棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因Asp55的克隆与特性研究.pdf

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1、万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S14800DissertationfortheDegreeofMasterCloningandCharacteristicAnalysisofANovelAsparticProteaseGeneAsp55fromTrichodermaasperellumACCC30536Candidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：Universit

2、y：KaiDOUZhiyingWangZhihuaLiuMasterForestProtectionJune．2014NortheastForestry万方数据摘要lYllll／112／llll7lllllll2lllllllllllll2lllll5llllll／zllllY272125Z由木霉分泌的天冬氨酸蛋白酶在木霉的生物防治机制中起到了十分重要的作用。为了研究棘孢木霉ACCC30536中天冬氨酸蛋白酶的功能，以棘孢木霉ACCC30536转录组测序数据为基础，设计引物克隆到了天冬氨酸蛋白酶基因Asp55的DNA序列和编码区序列，GenBank接收号分别

3、为KF029762和K_F976813。其中DNA全长1920bp，包含3个外显子及2个内含子，cDNA全长1602bp，编码533个氨基酸。生物信息学分析表明，该天冬氨酸蛋白酶ASP55分子量为55．4kDa，等电点是4．39，属于Asp蛋白家族。通过多序列比对发现，ASP55序列中含有特征性催化指纹“DTGS”和“DSGT”。SingalP预测表明，ASP55具有N端信号肽序列，是一种分泌蛋白，剪切位点为AEA．AD，位于第21位氨基酸与22位氨基酸之间。以天冬氨酸蛋白酶ASP55为比对序列，通过BlastP程序在棘孢木霉CBS433．97基因组中搜索到

4、了19种编码天冬氨酸蛋白酶的基因，说明了天冬氨酸蛋白酶在木霉中的多样化存在。通过实时荧光定量方法，研究了棘孢木霉ACCC30536天冬氨酸蛋白酶基因Asp55及MYB转录因子基因gybl．Mybl5在8种条件下的表达特性。当棘孢木霉在MM培养基中培养48h、l％山新杨茎粉诱导培养基中培养24h、1％杨树叶枯病菌细胞壁诱导培养基中培养48h、5％杨树叶枯病菌发酵液诱导培养基中培养24h时，Asp55的表达上调至最高点，分别是其在Oh时间点表达量的3．9、3．5、5．9和5．5倍。当棘孢木霉在氮源缺失诱导培养基中培养8h、碳源缺失诱导培养基中培养12h、1％山新

5、杨根粉诱导培养基中培养2h、1％山新杨叶粉诱导培养基中培养2h时，Asp55的表达量下调至最低点，是其在oh时间点表达量的7．7、15、8．8和9．5％。15种转录因子基因中，Myb2的表达方式与Asp55的最相似。将克隆得到的天冬氨酸蛋白酶基因Asp55cDNA序列与原核表达质粒pGEX一4T-2构建出原核表达载体pGEX．Asp55。pGEX．Asp55转化入大肠杆菌BL21后成功得到原核表达菌株BL21．Asp55，经过诱导表达成功获得了重组蛋白rASP55。对重组蛋白rASP55纯化后进行抑菌实验，rASP55对杨树叶枯病菌菌丝生长的抑制率为15．1

6、％。本研究充分证明了天冬氨酸蛋白酶对木霉抑菌作用的重要性，为今后无公害杀菌剂产品的研发提供了理论依据和方法，对解决目前我国无公害杀菌剂短缺的现象有重要的实用价值。关键词棘孢木霉；天冬氨酸蛋白酶ASP55；生物防治；原核表达万方数据AbstractProteasessecretedbyTrichodermaspp．playimportantrolesinbiocontrolofplantdisease．AccordingtothedataoftranscriptomicssequenceofTmperellumACCC30536，primersweredesi

7、gnedtoamplifytheDNAandcDNAsequencesoftheasparticproteasegeneAsp55inZasperellumACCC30536．Oncesequenced，theDNAandcDNAsequencesofAsp55weredepositedinGenBankandgettheaccessionnumberofKF029762andKF976813，respectively．TheDNAsequenceofAsp55is1,920bpinlength，containing3extronsand2introns．T

8、hecDNAsequenceofAsp55is1，6