棘孢木霉菌的分子标记研究.pdf

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1、万方数据MolecularmarkersofTrichodermaasperellumThesissubmittedtoQngdaoAgriculturalUniversityInfulfillmentoftheRequirmentFortheDegreeofMasterofScienceLiuLu(CollegeofLifeSciense)Supervisor：AssociateProf．XianHongquanQingdao．ChinaJune，2012万方数据独创性l声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和

2、致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：五，)懈时间：矽7肛加易日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生虢垂77导师签名：l妣骏时

3、l武：矽}y年6恩秘日时间：汐，夕年多月多阳万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要棘孢木霉菌的分子标记研究摘要木霉-菌(Trichodermaspp．)是一类应用广泛的拮抗微生物，对多种植物病原菌都有防治作用。棘孢木霉T4是由本实验室筛选的一株对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、镰刀菌(Fusariumspp．)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeriaberengeriana)和苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等多种土传病原真菌有很强拮抗作用的生防真菌。根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacteriumtumefaci

4、ensmediatedtransformation．ATMT)与传统转化方法相比，具有低拷贝、高转化率、操作简单、遗传稳定等优点，目前已广泛用于丝状真菌的转化中。绿色荧光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)作为报告基因，能在活细胞中表达并发出绿色荧光，而且不需要外源底物或其他辅助因子，GFP具有敏感的标记检测率而且没有毒害性，可以对标记菌株进行跟踪观察。本试验构建了适合农杆菌转化的含有egCp基因和潮霉素B抗性基因的双标记载体PPE，通过农杆菌AGL．1成功转化棘孢木霉T4，筛选稳定、高效表达egO?基因并对潮霉素产生抗性的双标记突变株，并从诱导培养基(I

5、M)和共培养培养基(CM)培养基中乙酰基丁香酮(AS)的浓度、农杆菌的浓度、棘孢木霉T4孢子浓度、共培养时间四个方面优化了棘孢木霉菌的转化体系。研究结果如下：(1)将潮霉素抗性基因(细办)插入pROKII质粒中，构建了中间载体PPl，并利用PPl载体，通过农杆菌介导转化法转化棘孢木霉菌，摸索转化棘孢木霉菌的最优条件是：IM和CM培养基中AS浓度为200p酌nL，农杆菌OD600值为0．6．0．8、用量200此，棘孢木霉T4孢子浓度为106／mL，共培养时间为48h，转化效率约为50个转化子／106个孢子。(2)构建含绿色荧光蛋白基因(劝)表达盒质粒18T-EGFP质粒，并将绿色荧

6、光蛋白表达盒插入中间载体PPl中，构建了潮霉素抗性和绿色荧光蛋白基因双标记载体PPE。(3)获得了潮霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因双标记棘孢木霉菌转化株。关键词：棘孢木霉菌；农杆菌；绿色荧光蛋白；基因标记；体系优化万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractMolecularmarkersof撇hoAbstractTrichodermaspp．areanimportantbiocontrolfungus，Ithadimportantappliedvalueinthebiocontrolofplantdiseases，TrichodermaasperellumT4isselec

7、tedbyourlaboratory,WhichisantagonismforRhizoctoniasolani，Fusariumspp．BotryosphaeriaberengerianaandColletotrichumgloeosporioides．ComparedWithothertraditionaltransformationmethod，Agrobacteriumtumefaciensmediatedtransformationsystemhaslowtocopy，