枯草芽孢杆菌转化方法的建立和Pglv高效表达载体的构建.pdf

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1、巧古学化化义＞枯草芽拖杆菌转化方法的建立和巧／Ｖ髙效表达载体的构建：均Ｖ．嗦＇‘＇．．：；嚴：．杳Ｋ来早托’．＇非．＇＇一‘：＞蘇：：．７旬牛福星１，片？＾；．■．嘴巧＾冬■＇‘一．身＇；谭Ｔ；这二〇—五年五月ｆ■＊－、＇．＞？■？－？：＇．．■ｖ．：，．：＇．？／，Ｉ？．－！．．■’一■＇村：南；＇巧巧＾；苗群躬辩棘巧知■－－；ｖ＇一－＇＂＇＇ｒ，－墙．．卢；４ｆ．．

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3、本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可将学

4、位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于；□保密，在年解密后适用授权。囚不保密。＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）？论文作者签名？：丰日期；沁／；年＾月户曰指导教师签名日期；＞〇户年《月日＾作者联系电话：电子邮箱；枯草芽抱杆菌转化方法的建立和戶如Ｖ高效表达载体的构建摘要大厮杆菌表达系统，虽然它的载体、受体系统已经比较成熟完善，一但其表达产物容易形成包涵体，分泌效率低，此外大肠杆菌是种潜在病原菌，生

5、长过程中不断释放脂多糖热原物质等内毒素，目前已被限制用于表达生产医药和食品。枯草芽跑杆苗（風妃）作为表达系统具有无致病性，不产生内毒素，严格生长在有氧条件下，容易将表达蛋白分泌到培养基中ａ－。此外芽跑杆菌的发酵技术已经非常成熟，如淀粉酶、蛋白酶等商品化的酶都是利用枯草芽抱杆菌生产的。本实验着重构建可调控的枯草芽拖杆菌高效表达载体。从筛选强麦芽糖启动子出发／Ｖ，并成功构建了麦芽糖诱导型表达载体户各－ＨＣＭＣ０４Ｐ，并通过转化方法比较、优化得出最适转化枯草芽抱杆茵４的方法：低盐环境饥饿法，即Ｓ法，

6、转化效率达到１．２ｘｌ〇ＣＦＵ／帖ＤＮＡ；后为了研究所构建的表达载体特化本实验从大小基因及信号肤方面着手、，通过连接红色焚光蛋白带有地衣芽抱杆菌信号肤的高温淀粉酶基因、去掉信号狀的地衣芽拖杆菌高湿淀粉酶基因、带有灰一色链霉菌信号肤的淀粉酶基因等系列报告基因对其特性研究得出：小基因在枯草中表达的可能性及大基因在枯草中表达需要带信号肤，且枯草在分泌胞外蛋白时对不同属的信号肤具有识别作用。然后对连Ｉ接有地衣芽抱奸菌信号肤的商温淀粉酶基因进行发酵条件优化，从最适麦芽搪添加量、最适诱导温度、最适诱导物添

7、加时间、和最适接种量几方面着手，进行单因素发酵条件优化，得出了最适的发酵条件，艮）６达到０．．Ｐ：将过夜培养菌株接种２％至饼〇〇５５时添加１５％麦芽糖，°Ｕ３５Ｃ下诱导，酶活达最高至２．５３（／ｍＬ）。最后通过反向ＰＣＲ技术—将麦芽糖启动子内部的代谢物阻遏元件ｅｒｅ序列进行定点ＣＧＡＴ的突变，并在ｍ上优化的实验基础上再次测定酶活力，得出高速产酶时１２／。，且酶活力提高了近五倍．２（ＵｍＬ）间提前，达到关键词：枯草芽袍杆菌转化方法麦芽糖启动子报告基因信号肤发酵优化ＣＷ位点酶活为凸ＥＳＴＡ

8、ＢＬＩＳＨＭＥＮＴＯＦＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＭＥＴＨＯＤ￥ＯＲＡｍＣＯＮＯＦＢＡＣＩＬＬＵＳＳＵＢＴＩＬＩＳＳＴＲＵＣＴＩＯＮｉＰＧＬＦＥＸＰＲＥＳ巧ＯＮＶＥＣＴＯＲＦＯＲＨＩＧＨＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ