重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

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1、硕士学位论文重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达作者姓名王海学科专业医药生物学指导教师叶燕锐副教授所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2018年5月EfficientOverexpressionofRecombinantPullulanaseinBacillusSubtilisADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：WangHaiSupervisor：YeYanrui,AssociateprofessorSouthChinaUniversityo

2、fTechnologyGuangzhou,China分类号：Q81学校代号：10561学号：201520133692华南理工大学硕士学位论文重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达作者姓名：王海指导教师姓名、职称：叶燕锐副教授申请学位级别：理学硕士学科专业名称：医药生物学研究方向：微生物酶学论文提交日期：2018年05月25日论文答辩日期：2018年06月01日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：戴仁科委员：凌飞罗晓春李晶关溯摘要普鲁兰酶(EC3.2.1.41)是一种淀粉脱支酶，能专

3、一性水解普鲁兰多糖、支链淀粉等多糖中的α-1,6糖苷键，是淀粉加工工业中不可或缺的关键酶。枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis）是公认安全（GRAS）菌株，且可将具有活性的天然蛋白直接分泌到培养基中。本文以一株能够高效表达外源蛋白质的BacillussubtilisATCC6051基因突变菌株BacillussubtilisATCC6051△10为出发菌株，构建普鲁兰酶枯草芽孢杆菌表达系统，通过启动子优化和发酵条件优化，不仅在枯草芽孢杆菌中实现并提高了普鲁兰酶的胞外表达，为解决国内对进口普鲁兰酶的依赖问

4、题提供有价值的菌株，也为枯草芽孢杆菌有效表达其他外源蛋白提供了思路。本研究重点研究如何提高普鲁兰酶的表达量，主要研究内容如下：（1）天然启动子的筛选。从芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌中选取了19个启动子，分别研究其对普鲁兰酶基因pul在枯草芽孢杆菌中表达的影响，成功筛选出了6个活性较高的启动子，分别是启动子P43、PspovG、PsigW、Ppgk、PsodA和PamyL。（2）普鲁兰酶基因的选择。选取Bacillusnaganoensis的普鲁兰酶基因pul及其突变体pul

5、324和Bacillusacidopullulyticus的普鲁兰酶基因pulA，分别以强启动子P43和PspovG介导其进行分泌表达，酶活数据显示，启动子PspovG介导的普鲁兰酶pul表达量最高，摇瓶发酵72h达到389.85U/mL。（3）对强启动子P43、PspovG、PsigW和PamyL进行两两串联，研究串联启动子对普鲁兰酶pul在枯草芽孢杆菌中表达的影响。酶活数据显示，串联启动子PamyL-PspovG介导的普鲁兰酶表达量最高，发酵72h达到620.80U/mL，远远高于单启动子菌株BE105（Ps

6、povG-pul）的389.85U/mL，酶活提高了59.24%。（4）通过对普鲁兰酶的酶学性质进行研究，进一步确认重组普鲁兰酶pul的最适pH为5.0，最适温度为57.5℃，在pH5.5~6.5和45~55℃内具有较好的pH稳定性和热稳定性，适宜保存于-20℃中。加入低浓度的金属离子Mg2+、Zn2+和Ca2+等可以提高普鲁兰酶酶活力，但是随着浓度的提高，促进作用逐渐转变成抑制作用，浓度越高抑制作用越显著。（5）对工程菌BE307进行发酵优化。初步优化后的发酵培养基为:木糖2%，酵母粉2%，玉米粉4%，棉籽饼粉

7、5%，Tween-80为2.0%，硫酸卡那霉素初始浓度为20Iμg/mL，硫酸卡那霉素补加浓度为5μg/mL。优化后的发酵条件为:培养基初始pH为7.0，发酵温度为37℃，接种量为5%。根据工业发酵需要，分别使用2%蔗糖和5%玉米浆干粉替代2%木糖和2%酵母粉，摇瓶发酵72h酶活最高达到1352.61U/mL，与发酵优化前的酶活（620.80U/mL）相比，提高了117.88%。关键词：普鲁兰酶；串联启动子；枯草芽孢杆菌；长野芽孢杆菌IIAbstractPullulanase(EC3.2.1.41)isastar

8、chdebranchingenzymethatspecificallyhydrolyzesα-1,6glucosidiclinkagesinpolysaccharidessuchaspullulanandamylopectin,anditisanindispensableenzymeinthestarchprocessingindustry.Bacillussubtili