抗生素微生物检定法.ppt

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1、第五模块生物检测技术第八章　抗生素微生物检定法掌握抗生素微生物检定法的基本原理；理解浊度法的测定原理；掌握管碟法二剂量法的具体操作步骤及相关注意事项能使用管碟法对药物进行效价测定学习目标技能目标知识目标复习提问液相色谱定性、定量方法要有哪几种？1.2.3.液相色谱法流程。液相色谱法定性和定量依据。新课大纲第一节抗生素微生物检定法一、概述二、标准品及效价三、管碟法一、概述－－系指在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法，能够直观地反应抗生素总的抗菌

2、能力。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。特点：灵敏度高、用量少、专属性不强抗生素微生物检定法是指当标准品和供试品属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内相互平行。即“同种物质，同种反应”，因此每种抗生素有着各自的效价单位，不同抗生素之间的效价单位没有可比性。量反应平行线原理3.方法分类:扩散法浊度法稀释法分为：国际通用法定方法:扩散法中的管碟法①管碟法又称管碟琼脂扩

3、散法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品二者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。在一定范围内，抗生素溶液的对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比，根据抑菌圈的大小计算出抗生素溶液的浓度。管碟法分为三种方法　一剂量法又称标准曲线法，常用于原料生产的过程监控、中间体或半成品检验；二剂量法是抗生素质量检验的常规方法；三剂量法主要用于标准品的标定。中国兽药典（2005年版）收载了二剂量法和三剂量法。②浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后

4、细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。二、抗生素标准品及效价单位定义:标准物质国家与国际标准品标准品的基本要求使用保存抗生素效价单位:单组份和多组分指抗生素药物的作用强度。用单位“IU”作为其有效成分的一总衡量尺度。目前，抗生素的剂量原则上以纯品的重量表示，并加注单位。如土霉素0．25克（250000单位）即1毫克=1000单位；个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。抗菌效价：T2S1S2T1三、管碟法扩散现象：由球面扩散动力学公式表示相当于直线方

5、程：y=bX+c抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈直径的大小呈直线关系，来测定抗生素抗菌活性。1.理论依据：2.影响因素?Ⅰ超净工作台Ⅲ双碟Ⅱ抑菌圈测量仪Ⅴ钢管Ⅳ陶瓦盖Ⅵ恒温培养箱Ⅷ玻璃仪器Ⅸ游标卡尺Ⅹ缓冲液Ⅺ培养基Ⅻ试验菌Ⅶ灭菌刻度吸管3.仪器用具材料抑菌圈（抗生素效价）自动测量分析仪③菌悬液的制备⑦检定法④标准品溶液的制备⑤供试品溶液的制备⑥双碟的制备②灭菌缓冲溶液①培养基及其制备方法4.测定方法类别实验菌培养基PH链、卡庆、红枯草芽胞杆菌Ⅰ7.8-8.0四、土氯、林滕黄八叠球菌Ⅱ6.5-6.6水100

6、0ml磷酸二氢钾1.32g磷酸氢二钾3.68g氯化钠3.sg酵母浸出粉3g胨5g牛肉浸出粉1.5g葡萄糖1g培养基①培养基及其制备方法除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节P值使灭菌后为7．0～7．2，在115oC灭菌3分钟，即得。磷酸盐缓冲液（PH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115oC灭菌30分钟，即得。磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115oC灭菌30分钟，即得

7、。②灭菌缓冲液枯草芽抱杆菌悬液　　取枯草芽抱杆菌（63501）的普通琼脂斜面培养物，接种于盛有普通琼脂斜面培养基的培养瓶中，在35－37oC培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65oC加热30分钟，即得。短小芽抱杆菌悬液　　取短小芽抱杆菌（63202）的普通琼脂料面培养物，照上述方法制备，即得。③菌悬液的制备标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照附表的规定进行稀释。精密称（或量）取供试品适量，用各该药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照附表的规

8、定稀释至与标准品相当的浓度。④标准品溶液的制备⑤供试品溶液的制备取内径90mm、高16—17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48－50oC（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18－24mm。⑥双碟的制备二剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于