发酵分析—抗生素微生物检定法.ppt

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1、抗生素微生物检定法前言抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下原因：前言微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素药品的抗菌活性；多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。所以抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不可能取代微生物检定

2、法。1定义——抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。1.定义－抗菌活性抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性通常用效价单位来表示。在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地反映抗生素的医疗价值。硫酸链霉素798单位/毫克青霉素G钠1670单位/毫克杆菌肽74单位/毫克1.定义－抗生素效价定义在抗生素的生产、研究和应用等方面，均以抗生素活性成分的“活性”重量计量抗生素的效价单位，采用活性成分的“活性”重量1μg

3、＝1效价单位的方法表示。抗生素效价以“单位（u）”或“微克（μg）”表示。1.定义－抗生素效价定义例：硫酸链霉素抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱的“活性”重量表示的，即1链霉素效价单位＝1微克链霉素碱，这里是“活性微克”而不是“重量微克”。1.定义－抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法（2）比浊法（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。1.定义－稀释法通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不同浓度抗生素的液体培养

4、基中有无细菌的生长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方面。12345678一一一一一一一一不同浓度的抗生素液体培养基浓稀等量的试验菌菌液1.定义－比浊法通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物的含量（效价）测定。1.定义－（琼脂）扩散法通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素药物的含量（

5、效价）测定。抗生素微生物检定方法比较：1.定义－管碟法此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。SHTHTLSL2.原理－抑菌圈的形成两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于

6、抗生素最低抑菌浓度。2.原理－量反应平行线原理量反应平行线原理：“在属量反应的指标中，当对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条对数剂量和反应关系直线相互平行”。2.原理－量反应平行线原理在抗生素微生物检定法中，一定剂量范围内，抗生素对数剂量与其所致抑菌圈的大小呈直线关系。这就在理论上决定了，（活性）成分相同的标准品与供试品在一定剂量范围内产生的两条剂量反应直线相互平行，符合量反应平行线原理的基本要求。3.检定方法分类一剂量法（标准曲线法）二剂量法（2•2法）三剂量法（3•3法）二剂量法（2•2法）：用标

7、准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤预试验→试验准备→双碟底层的制备→供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备→滴加抗生素溶液→双碟的培养→抑菌圈的测量→结果的可靠性检验及效价测定3.1管碟法的操作步骤预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。高低

8、剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。3.1管碟法的操作步骤试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；