抗生素微生物检定法(实习总结)_医药卫生_专业资料

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1、抗生素微生物检定学习报告及总结抗生素微生物检定法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。管碟法（二剂量）测定抗生素的效价管碟法（cylinderplatemethod）是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试

2、验菌的琼脂平板上放置小钢管,管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。1实验材料1.1实验试剂抗生素检定培养基Ⅱ号、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、0.9%灭菌生理盐水1.2实验菌株及样品菌株为藤黄微球菌菌悬液，样品为车间生产的酒石酸泰乐菌素干粉。1.3实验仪器及设备玻璃烧杯、容量瓶、直径90mm的玻璃培养皿、刻度吸管、移液管、胶头吸管、不锈钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10

3、±0.lmm）、镊子、菌株培养茄瓶、三角烧瓶、温度计、多功能微生物自动测量分析仪、微波炉、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、2实验方法2.1实验用菌株制备提前将藤黄微球菌接种于茄瓶斜面培养基，置30℃左右温箱培养2～3天后取出放4℃储存。用时取出茄瓶于无菌环境下无菌操作，向茄瓶内加入5ml0.9%灭菌生理盐水，轻轻摇动茄瓶，将斜面细菌洗下制备成一定浓度的菌悬液（浓度大小以最终产生的抑菌圈大小在16～18mm之间而定）。2.2抗生素检定培养基的配制准确称取抗生素检定培养基Ⅱ号26.5g倒入三角烧瓶中，加入1000ml纯化水，混匀后塞上塞子，以牛皮纸包扎后于

4、115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用。2.3pH6.0磷酸盐缓冲液的配制用托盘天平称取磷酸氢二钾20g、磷酸二氢钾80g于1000ml三角烧瓶内，加入1000ml纯化水，搅拌溶解，混匀后于115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用。2.4标准品溶液和供试品溶液的配制标准品溶液：精密称取泰乐菌素标准品50mg，于小烧杯内用灭菌的pH6.0磷酸盐缓冲液溶解，溶解液转入50ml容量瓶中（烧杯冲洗3次），定容后制成1000u/ml的标准液置4℃冰箱备用。用时根据需要稀释成100u/ml、10u/ml、5u/ml的不同浓度（采用两步稀释法）。供试品溶液：精密称取酒石酸泰乐菌素供试品50m

5、g，同标准品同法溶解制成终用的10u/ml、5u/ml两个浓度的溶液。2.5实验过程（1）于半无菌间内制备检测用碟子：拿出配置好的培养基，取20ml加入到无菌平皿内，凝固后作为底层培养基。（2）用无菌刻度吸管吸取2ml藤黄微球菌菌悬液，加入到500ml48～50℃培养基内，摇匀后迅速以无菌吸管吸取5ml，注入到底层培养基上，作为菌层培养基。（3）于平皿内均匀放置4（二剂量法）或6（三剂量法）个小钢管，各钢管之间尽量等距。（4）点样：按照下图分别向钢管内加入标准液和供试液，每个供试品做8个平行。同时设立阴性和阳性对照。阴性对照的4个钢管内加样为pH6.0灭菌磷酸盐缓

6、冲液和高低浓度的标准溶液，阳性对照的4个钢管不加样。B3B1Y1Y3B3B2B1Y3Y1Y2B1：标准品低浓度溶液T1：供试品低浓度溶液B2：标准品中浓度溶液T2：供试品中浓度溶液B3：标准品高浓度溶液T3：供试品高浓度溶液（5）点样结束后，盖上陶瓦盖，将碟子平稳放置于35～37℃恒温培养箱内培养15～18小时即可取出测量。（6）于多功能微生物自动测量分析仪上测量抑菌圈大小，并出结果，记录。二剂量法计算公式：三剂量法计算公式：P为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）S1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和S2为标准品中浓度溶液所致抑菌圈直径（或

7、面积）的总和S3为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和T2为供试品中浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和T3为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（或面积）的总和I为高低浓度剂量之比的对数值3结果判断3.1可靠性测验管碟法系根据量反应平行线原理儿设计，并要求在实验所用的剂量（浓度）范围内，对数剂量与反应呈直线关系。可靠性测验即通过对剂间变异的分析，一测验标准品和供试品的对数剂量与反应的关系是否显著偏离平行直线。用抑菌圈测量仪测量抑菌圈是，测量与统计学处理一次完成，统计学分析按药典附录的生物机电统计法进行F的

8、显著性测验