DNA的提取与鉴定.ppt

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1、核酸提取与鉴定一、核酸的理化性质核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。1、核酸的酸碱性质核酸含有酸性的磷酸基和碱性的含氮的碱基，因此核酸是两性的电解质，具有等电点。但磷酸基酸性相对较强，所以核酸通常表现为酸性。在一定的pH下，核酸能发生两性电离，从而使得核酸带上电荷，具有电泳行为。2、核酸的溶解度与黏度DNA与RNA都是极性化合物，都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。DNA的黏度很大，当DNA溶液受热或其他因素作用下，发生双螺旋结构变为无规则线团结构，此时黏度降低，因此可用黏度做为DNA变

2、性的指标。3、核酸的紫外吸收由于核酸的组成成分是嘌呤碱、嘧啶碱（带有共轭双键）具有强烈的紫外吸收，所以核酸表现出强烈的紫外吸收性质，其最大的吸收峰在260nm。3、增色效应(hyperchromiceffect)是指因高分子结构的改变，而使摩尔吸光系数增大的现象核酸变性时，双螺旋结构被破坏，嘌呤碱、嘧啶碱暴露出来，其紫外吸收能力增强。4、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性:在物理和化学因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双链解旋为单链的过程。核酸的降解:核苷酸间的磷酸二酯键的断裂引起核酸变性的因素有：高温、强酸强碱有机溶剂、尿素等当呈双螺旋结构

3、的DNA溶液缓慢加热时，其中的氢键便断开，双链DNA便脱解为单链，这叫做核酸的“溶解”或变性。在适宜的温度下，分散开的两条DNA链可以完全重新结合成和原来一样的双股螺旋。这个DNA螺旋的重组过程称为“复性”。热变性一半时的温度称为熔点或变性温度，以Tm来表示。DNA的G+C含量影响Tm值。由于G≡C比A=T碱基对更稳定，因此富含G≡C的DNA比富含A=T的DNA具有更高的熔解温度。根据经验公式xG+C=（Tm-69.3）×2.44可以由DNA的Tm值计算G+C含量，或由G+C含量计算Tm值。（二）复性变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为

4、复性（renaturation）。当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火（annealing）。DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：DNA浓度高，复性快；DNA分子大复性慢；高温会使DNA变性，而温度过低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度为Tm减去25℃，一般在60℃左右。离子强度一般在0.4mol/L以上。（二）基因基因(遗传因子)是具有遗传效应的DNA片段，基因支持着生命的基本构造和性能。编码区：是可以被转录的区域非编码区：不可以被转录的区域密码子：遗传密码(英文：Genetic code)是一组规则，将DNA或RNA序列以三个核苷酸为一组

5、的密码子转译为蛋白质的氨基酸序列，以用于蛋白质合成。起始密码子为AUG(甲硫氨酸)；终止密码子：UAA、UAG、UGA.细胞DNA的提取过程：裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。鉴定：浓度、纯度、分子量、测序（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）1、植物样品新鲜组织先用无菌生理盐水洗；干药材除去霉点，无菌水浸洗；（一）样品预处理（获取分散细胞）捣碎或剪碎；加液氮研磨成粉状。2、动物样品（1）组织样品：新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（或分装、-70℃/液氮低温

6、保存）；甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。（2）血细胞样品：（3）培养细胞：离心，弃细胞培养液；用缓冲液多次漂洗；来源：新鲜血液或者冻贮血液；抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸钠），不可使用肝素；分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）3、微生物培养物样品离心获取菌体细胞，加缓冲液洗涤，加缓冲液悬浮菌体细胞。4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。高速离心获取菌体细胞。用缓冲液洗涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。（二）提取用具预处理1、DNA提取用具的处理要求无菌

7、；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。2、RNA提取用具的处理要求无菌，防止二次污染。RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。二、真核生物基因组DNA的常规提取裂解细胞，溶出DNA除去杂质重新溶解DNA沉淀、浓缩DNA⒈破碎细胞，溶解DNA：用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等植物样品提取液：含CTAB核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），螯合这些离子。2、除去