DNA的粗提取与鉴定.ppt

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1、DNA的粗提取与鉴定一、课题重点与难点课题重点：DNA的粗提取和鉴定原理方法。课题难点：DNA的粗提取和鉴定原理方法。二、基础知识分析（一）DNA的提取原理1、DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同问题思考与讨论：①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？当氯化钠的物质的量浓度为2mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为0．14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶

2、液中溶解或析出？DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离2、DNA在酒精溶液中的溶解性3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响（二）、DNA的鉴定原理①DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂②甲基绿（绿色）三、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、

3、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜.2、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利

4、于DNA的溶解②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等.讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？（三）去除滤液中的杂质讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.讨论：方案二与方案三的

5、原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离.（四）DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。1、DNA的析出2、DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，

6、看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色．案例：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例②鸡血细胞极易吸水胀破鸡血细胞做实验材料的原因?①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得1、准备鸡血细胞液①过程：②柠檬酸钠作用:讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆.取柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。防止血液凝固2、方法步骤①提取鸡血细胞的细胞核物质②溶解细胞核内的DNA③析出含DNA的粘稠物④滤取含DN

7、A的粘稠物⑤将DNA的粘稠物再溶解⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液⑦提取含杂质较少的DNA⑧DNA的鉴定2、方法步骤将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。①提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至涨破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快