利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412.pdf

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1、利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍郑宇2014-12-18提纲•NGS测序简介•分析基本流程–质量过滤–比对–寻找变异–变异质量过滤–变异注释–家系或群体样本综合分析过滤（一）NGS测序简介DNA测序简介•针对单个小扩增片段进行的Sanger测序(1-1000bp)–目前是验证DNA序列突变的金标准•全基因组或全外显子组的第二代测序(Next-generationsequencing,NGS)(Illumina:30-150bp)–优点：是通量高，成本较低–缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域出现错误，无法对高重复区

2、域和单倍体型或杂合子序列等这些复杂区域进行测序•第三代测序–无需PCR实时测，读长更长，但通量低，准确性有待提高目标序列捕获测序•针对外显子组区域或用户定制的特定染色体区域，主要检测目标区域内的点变异•目标序列捕获测序可用于家系研究，也可用于较大样本量的病例-对照研究。对于已经完成连锁分析的家系，可将疾病连锁区间及附近的DNA区域或外显子序列进行捕获后进行测序•相比全基因组测序更加经济、高效，但由于捕获技术本身的局限性，也不能100%检测所有的外显子或目标区域（二）数据分析基本流程分析目的：变异检测•DNA变异常见类型：–单核苷酸多态（SNP）

3、和短片段插入缺失（Indel）–缺失（deletion）–插入（insertion）–倒位（inversion）–易位（translocation）–拷贝数变异（CNV）NGS数据分析基本流程实验室操作（DNA提取，文库制备…）测序（Illumina/SOLiD…）质量评估(数据产量和质量)，加测/重测数据并去除低质量碱基质量差或产量不足序列拼接组装（比对，去重，indel重新比对，碱基质量重新计算）测序比对率，覆盖度，深度评估覆盖度不够变异检测（SNP，Indel…；体细胞，生殖细胞)SNP&IndelSV突变注释（dbSNP，1000g，E

4、SP6500，DGV等，位置，功能，保守性，通路，蛋白互作网络…）突变筛选，可视化生成分析结果报告突变验证，提送临床医生，生产诊断报告第一步：原始下机数据bcl文件转换成fastq文件FASTQfileformatFASTQ文件示例，该文件包含一条序列：@SEQ_IDGATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT+!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65AFASTQ文件将每条序列用四行表示：第

5、一行以“@’”打头，后跟着序列ID，可加上序列描述（类似于FASTA文件的标题行）；第二行是序列内容；第三行以‘+’打头，后面的序列ID和描述可有可无；第四行是第二行序列每个位点的质量值，字符个数必须与第二行完全相同。以hiseq2000为例，一个run可产生6Greads（100bp读长）Fastq文件示例>>第二步：测序质量评估及过滤•评估数据产量和质量（Illumina报告示例），并根据需要去除接头污染和低质量序列，如：–FastQC可对Illumina和ABISOLiD测序序列质量进行快速评估（FastQC质量报告示例）–FASTX-T

6、oolkit和Galaxy即可评估序列质量，还可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行质量过滤第三步：将序列比对到参考基因组•目的：对测出的序列片段进行定位，看位于参考基因组上的哪个位置•生成SAM或BAM（二进制）文件–比对工具如：BWA，bowtie2，Illumina的HiseqAnalysisSoftware，SOAP等，我们用的BWAmemBam文件用igv工具展示示例•IntegratedGenomicsViewer(IGV)（http://www.broadinstitute.org/software/igv/home）–浏览大型基

7、因组数据的高性能交互式视图–整合了NCBIrefGene数据、hg19、hg18等不同版本的人类参考基因组–可在本地交互式查看局部比对–可同时查看多个样本的比对，支持多种数据类型第四步：变异检测•运用GATK/MuTect/VarScan/Atlas2/Samtools/SVDetect/Polymutt等工具包，查找SNP和Indel、缺失、插入、倒位、易位、CNV等–我们目前采用GATK工具包–GATK寻找SNP&Indel突变的流程图•GATKBestPractices（http://www.broadinstitute.org/gatk

8、/guide/best-practices）Snp&Indel生成VCF或者GVCF格式结果文件VCF格式vs.GVCF格式VCF格式##filefo