Rapamycin通过抑制内质网应激途径保护光损伤中视网膜感光细胞.pdf

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1、中文摘要Rapamycin通过抑制内质网应激途径保护光损伤中视网膜感光细胞目的：研究mTOR抑制剂Rapamycin保护光损伤中视网膜感光细胞（661w）的分子机制和信号途径。方法：将661w细胞暴露于2600Lux可见光，用MTT及碘化丙啶（PI）染色法检测细胞活性及细胞死亡率；用DCFH-DA方法检测细胞内活性氧簇(ROS)的变化；应用透射电子显微镜观察内质网的形态变化；通过WesternBlot和定量RT-PCR分别在蛋白和mRNA水平检测内质网应激标志物的变化。经过Rapamycin预处理后，利用WesternBlot和定量RT-PCR分别从蛋白表达和mR

2、NA转录水平检测mTOR途径下游因子及内质网应激的三条主要信号途径，包括:PERK、IRE1及ATF6通路的变化。此外，还应用经典内质网应激损伤细胞模型（DTT诱导）进一步验证Rapamycin是通过抑制内质网应激途径发挥神经保护作用。结果：在661w细胞光损伤模型中，光照导致内质网应激反应的三条下游信号通路激活，EIF2a、ATF4、CHOP、IRE1、BIP和ATF6在蛋白质表达和mRNA转录水平明显升高。Rapamycin能明显抑制mTOR的活化及其下游翻译起始因子4EBP1，p-4EBP1，P70，p-P70和磷酸化核糖体蛋白S6激酶（P-S6K）的表达。

3、Rapamycin显著降低光损伤所诱导的内质网应激标志蛋白表达与mRNA转录的上调。此外，在经典内质网应激损伤细胞模型中，Rapamycin分别在蛋白质和mRNA水平上同样表现出对内质网应激蛋白表达与转录上调的抑制作用。结论：在光损伤细胞模型中，可见光照射造成661w细胞内质网应激；mTOR抑制剂Rapamycin通过抑制内质网应激途径发挥保护作用；同时在经典内质网应激损伤细胞模型中也证实Rapamycin是通过抑制内质网应激途径对661w细胞发挥保护作用；Rapamycin可能成为治疗视网膜光损伤一种潜在的神经性保护药。关键词：视网膜光损伤；内质网应激；神经保护

4、；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素(Rapamycin)；感光细胞(661w细胞)IAbstractRapamycinattenuatesvisiblelight-inducedinjuryinretinalphotoreceptorcellsviainhibitingendoplasmicreticulumstressPurposeTheobjectiveofthisstudywastoinvestigatethemolecularmechanismsandsignalingpathwaythatrapamycinprotects661Wcellsfromvis

5、iblelight-inducedinjury.MethedsAfter661Wcellswereexposedto2600-Luxlight,cellviabilityanddeathweremonitoredwithMTTandpropidiumiodidestaining.Thechangesofreactiveoxygenspecies(ROS)inthe661Wcellswasdetectedwitha2',7'-dichlorfluorescein-Diacetate(DCFH-DA)assay.Weexaminedthemorphologyofthe

6、ERwithtransmissionelectronmicroscopy.WeexaminedthechangesofERstressmarkersusingwesternblotandquantitativeRT-PCR.Rapamycinpretreatmentsignificantlysuppressedlight-inducedERstressandallthreemajorbranchesoftheunfoldedproteinresponse(UPR),includingPERK,IRE1andATF6pathwaysbothattheproteina

7、ndmRNAlevels.Additionally,theinhibitionofERstressbyrapamycinwasfurtherconfirmedwithadithiothreitol(DTT;aclassicalERstressinducer)-damaged661Wcellmodel.ResultsLightexposureleadtoremarkableup-regulationofEIF2a,ATF4,CHOP,IRE1,BIP,andATF6,bothattheproteinlevelandthemRNAlevel,whichrepresen

8、tthre