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时间:2020-03-04
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1、中文摘要Rapamycin通过抑制内质网应激途径保护光损伤中视网膜感光细胞目的:研究mTOR抑制剂Rapamycin保护光损伤中视网膜感光细胞(661w)的分子机制和信号途径。方法:将661w细胞暴露于2600Lux可见光,用MTT及碘化丙啶(PI)染色法检测细胞活性及细胞死亡率;用DCFH-DA方法检测细胞内活性氧簇(ROS)的变化;应用透射电子显微镜观察内质网的形态变化;通过WesternBlot和定量RT-PCR分别在蛋白和mRNA水平检测内质网应激标志物的变化。经过Rapamycin预处理后,利用WesternBlot和定量RT-PCR分别从蛋白表达和mR
2、NA转录水平检测mTOR途径下游因子及内质网应激的三条主要信号途径,包括:PERK、IRE1及ATF6通路的变化。此外,还应用经典内质网应激损伤细胞模型(DTT诱导)进一步验证Rapamycin是通过抑制内质网应激途径发挥神经保护作用。结果:在661w细胞光损伤模型中,光照导致内质网应激反应的三条下游信号通路激活,EIF2a、ATF4、CHOP、IRE1、BIP和ATF6在蛋白质表达和mRNA转录水平明显升高。Rapamycin能明显抑制mTOR的活化及其下游翻译起始因子4EBP1,p-4EBP1,P70,p-P70和磷酸化核糖体蛋白S6激酶(P-S6K)的表达。
3、Rapamycin显著降低光损伤所诱导的内质网应激标志蛋白表达与mRNA转录的上调。此外,在经典内质网应激损伤细胞模型中,Rapamycin分别在蛋白质和mRNA水平上同样表现出对内质网应激蛋白表达与转录上调的抑制作用。结论:在光损伤细胞模型中,可见光照射造成661w细胞内质网应激;mTOR抑制剂Rapamycin通过抑制内质网应激途径发挥保护作用;同时在经典内质网应激损伤细胞模型中也证实Rapamycin是通过抑制内质网应激途径对661w细胞发挥保护作用;Rapamycin可能成为治疗视网膜光损伤一种潜在的神经性保护药。关键词:视网膜光损伤;内质网应激;神经保护
4、;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白;雷帕霉素(Rapamycin);感光细胞(661w细胞)IAbstractRapamycinattenuatesvisiblelight-inducedinjuryinretinalphotoreceptorcellsviainhibitingendoplasmicreticulumstressPurposeTheobjectiveofthisstudywastoinvestigatethemolecularmechanismsandsignalingpathwaythatrapamycinprotects661Wcellsfromvis
5、iblelight-inducedinjury.MethedsAfter661Wcellswereexposedto2600-Luxlight,cellviabilityanddeathweremonitoredwithMTTandpropidiumiodidestaining.Thechangesofreactiveoxygenspecies(ROS)inthe661Wcellswasdetectedwitha2',7'-dichlorfluorescein-Diacetate(DCFH-DA)assay.Weexaminedthemorphologyofthe
6、ERwithtransmissionelectronmicroscopy.WeexaminedthechangesofERstressmarkersusingwesternblotandquantitativeRT-PCR.Rapamycinpretreatmentsignificantlysuppressedlight-inducedERstressandallthreemajorbranchesoftheunfoldedproteinresponse(UPR),includingPERK,IRE1andATF6pathwaysbothattheproteina
7、ndmRNAlevels.Additionally,theinhibitionofERstressbyrapamycinwasfurtherconfirmedwithadithiothreitol(DTT;aclassicalERstressinducer)-damaged661Wcellmodel.ResultsLightexposureleadtoremarkableup-regulationofEIF2a,ATF4,CHOP,IRE1,BIP,andATF6,bothattheproteinlevelandthemRNAlevel,whichrepresen
8、tthre
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