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《FicolinA的克隆、 蛋白表达和抗体的制备与鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、FicolinA的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定【摘要】目的：克隆小鼠ficolinA(mouseficolinA)基因，构建在真核及原核表达载体，并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白，并制备其抗体，以进一步用于研究小鼠ficolinA的功能。方法：用RTPCR的方法从新生7d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacerkit扩增ficolinAcDNA片段，并将该片段分别插入pVAX1真核表达载体及pGEXKG原核表达载体中，实现插入基因的融合，在TPTG的诱导下在大肠杆菌中表达。用GSTSephar
2、ose4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化，用SDSPAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。制备ficolinA的多克隆抗体并对其效价进行测定。结果：成功地构建了pVAX1ficolinA真核表达载体及pGEXKGficolinA原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效的表达，表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。并且成功制备了多克隆抗体。结论：成功地构建了重组表达载体pVAX1ficolinA及pGEXKGficolinA,并在E.coliBL21中表达了ficolinA蛋白，为下一步研
3、究小鼠ficolinA的功能奠定了基础。【关键词】小鼠ficolinA;基因克隆；蛋白表达；抗体纤维胶凝蛋白(ficolin)存在于多种动物和人体内，组织分布广泛。作为一种转化生长因子1结合蛋白(TGFB)从猪的子宫内膜中分离出来。Ficolin与甘露聚糖结合凝集素(mannanbindinglectin,MBL)具有类似的结构和功能，属于补体凝集素的一种。它们是天然免疫中一种重要的“一线防御'，分子，也是继胶原凝素之后的一种重要的糖类模式识别分子［7］。Ficolin的一级结构和空间结构肽链跟MBL和
4、补体蛋白Clq分子相似。研究显示：ficolin很可能像Clq分子和胶凝素那样，通过其球形的“头部，，与病原体的糖类结合位点结合，而其胶原样区介导调理吞噬［1,2］oFicolin介导的调理吞噬可能通过两条途径进行：一是与病原体结合后激活MASP,后者裂解补体产生C3b,C4b等调理素，以促进吞噬细胞内吞作用。二是直接与吞噬细胞表面的ficolin特异性受体结合，从而拉进了病原体与吞噬细胞之间的距离，利于病原体被吞噬和清除［7］。鼠ficolinA与猪的ficolin、人ficolin1、ficolin
5、2氨基酸序列的同源性分别是60.2.59.8、59.8和59.6%。鼠ficolinA在肝脏和脾脏中高表达［5,6L我们成功克隆了小鼠ficolinA(mouseficolinA)基因，构建在真核及原核表达载体上，纯化了在大肠杆菌中过度表达ficolinA蛋白，并制备其抗体，为进一步研究ficolinA蛋白的功能奠定基础。1材料和方法1.1材料孕C57BL/6小鼠(SPF3级，雌性)购自武汉大学动物中心，真核表达载体PVAX1,原核表达载体pGEXKG,大肠杆菌E.coliDH5a和E.coliBL21
6、菌株均由本实验室保存。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、蛋白质质量标准购自MBT公司，异丙基硫代
7、3D半乳糖甘(IPTG)为Amresco公司产品，GlutathioneSepharose4B亲和层析柱购自Pharmacia公司。兔抗GST抗体由本室制备，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IG购自Promega公司.Generacerkit购于Invitrogen公司。引物的设计与合成：根据Genebank的ficolinA基因序列(031348)设计引物，上游引物为：巳GGATCATATGCAGTGGCCTA
8、CGC3Z,含有BamHI酶切位点；下游引物为：5ZCAAGCTTGAGACTGGGGCACCTTA丁,含有EcoRI酶切位点•引物由上海生工合成。1.2方法1.2.1目的基因的扩增与纯化从出生1周以内的C57小鼠肝脏中提取总RNA,运用GeneRacer试剂盒进行逆转录PCR,得到小鼠ficolinAcDNA后，采用上述引物从ficolinA基因起始密码子处开始进行PCR扩增，并使ficolinA基因与GST基因处于同一阅读编码框架•扩增反应的条件为：95C预变性3min,以95€变性50s,55°C
9、退火36s,72°C延伸1min,22个循环后，再于72°C延伸10min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下，用DNA回收试剂盒回收并纯化。1.2.2重组质粒pGEXKGficolinA和pVAX1ficolinA的构建与鉴定将纯化的PCR产物和载体pGEXKG及pVAX1用EcoRI和BamHI双酶切后，分别回收酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向将ficolinA基因片段与pGEXKG及pVAX1连接，以连
