ficolina的克隆、 蛋白表达和抗体的制备

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1、FicolinA的克隆、蛋白表达和抗体的制备【摘要】目的:克隆小鼠ficolinA（mouseficolinA）基因,构建在真核及原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白,并制备其抗体,以进一步用于研究小鼠ficolinA的功能。方法:用RTPCR的方法从新生7d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacerkit扩增ficolinAcDNA片段,并将该片段分别插入pVAX1真核表达载体及pGEXKG原核表达载体中,实现插入基因的融合,在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达。用GSTSepharo

2、se4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化,用SDSPAGE和r)同预期值相一致。并且成功制备了多克隆抗体。结论:成功地构建了重组表达载体pVAX1ficolinA及pGEXKGficolinA,并在E.coliBL21中表达了ficolinA蛋白,为下一步研究小鼠ficolinA的功能奠定了基础。【关键词】小鼠ficolinA;基因克隆;蛋白表达;抗体纤维胶凝蛋白（ficolin）存在于多种动物和人体内,组织分布广泛。作为一种转化生长因子1结合蛋白（TGFβ）从猪的子宫内膜中分离出来。Ficol

3、in与甘露聚糖结合凝集素（mannanbindinglectin,MBL）具有类似的结构和功能,属于补体凝集素的一种。它们是天然免疫中一种重要的“一线防御”分子,也是继胶原凝素之后的一种重要的糖类模式识别分子［7］。Ficolin的一级结构和空间结构肽链跟MBL和补体蛋白C1q分子相似。研究显示:ficolin很可能像C1q分子和胶凝素那样,通过其球形的“头部”与病原体的糖类结合位点结合,而其胶原样区介导调理吞噬［1,2］。Ficolin介导的调理吞噬可能通过两条途径进行:一是与病原体结合后激活MASP,后者裂解补

4、体产生C3b,C4b等调理素,以促进吞噬细胞内吞作用。二是直接与吞噬细胞表面的ficolin特异性受体结合,从而拉进了病原体与吞噬细胞之间的距离,利于病原体被吞噬和清除［7］。鼠ficolinA与猪的ficolin、人ficolin1、ficolin2氨基酸序列的同源性分别是60.2、59.8、59.8和59.6%。鼠ficolinA在肝脏和脾脏中高表达［5,6］。我们成功克隆了小鼠ficolinA（mouseficolinA）基因,构建在真核及原核表达载体上,纯化了在大肠杆菌中过度表达fico

5、linA蛋白,并制备其抗体,为进一步研究ficolinA蛋白的功能奠定基础。1材料和方法1.1材料孕C57BL/6小鼠（SPF3级,雌性）购自武汉大学动物中心,真核表达载体pVAX1,原核表达载体pGEXKG,大肠杆菌E.coliDH5α和E.coliBL21菌株均由本实验室保存。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、蛋白质质量标准购自MBI公司,异丙基硫代βD半乳糖甘(IPTG)为Amresco公司产品,GlutathioneSepharose4B亲和层析柱购自Pharmacia公司。兔抗GST抗体由本室

6、制备,辣根过氧化物酶标记羊抗兔IG购自Promega公司.Generacerkit购于Invitrogen公司。引物的设计与合成:根据Genebank的ficolinA基因序列(031348)设计引物,上游引物为:5′GGATCATATGCAGTGGCCTACGC3′,含有BamHⅠ酶切位点;下游引物为:5′CAAGCTTGAGACTGGGGCACCTTA3′,含有EcoRI酶切位点.引物由上海生工合成。1.2方法1.2.1目的基因的扩增与纯化从出生1周以内的C57小鼠肝脏中提取总RNA,运用GeneRac

7、er试剂盒进行逆转录PCR,得到小鼠ficolinAcDNA后,采用上述引物从ficolinA基因起始密码子处开始进行PCR扩增,并使ficolinA基因与GST基因处于同一阅读编码框架.扩增反应的条件为:95℃预变性3min,以95℃变性50s,55℃退火36s,72℃延伸1min,22个循环后,再于72℃延伸10min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA回收试剂盒回收并纯化。1.2.2重组质粒pGEXKGficolinA和pVAX1ficolinA的构建与鉴定

8、将纯化的PCR产物和载体pGEXKG及pVAX1用EcoRI和BamHI双酶切后,分别回收酶切产物,在T4DNA连接酶作用下定向将ficolinA基因片段与pGEXKG及pVAX1连接,以连接产物转化入DH5α感受态细菌,分别在LB(Amp)及LB（Kan+）培养基中筛选培养。挑取阳性克隆,培养后小量提取质粒,用EcoRI和BamHI