胃泌素调控ERK信号通路在促进大肠癌CACO2细胞增殖中的作用 优先出版.pdf

《胃泌素调控ERK信号通路在促进大肠癌CACO2细胞增殖中的作用 优先出版.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、·401·中国临床药理学与治疗学◇基础研究◇中国药理学会主办CN34-1206/Ｒ，ISSN1009-2501http://www．cjcpt．com2017Apr;22(4):401－405胃泌素调控EＲK信号通路在促进大肠癌CACO2细胞增殖中的作用茆家定，胡迪，吴佩皖南医学院弋矶山医院胃肠外科，芜湖241001，安徽摘要目的:利用ＲNA干扰技术探讨EＲK1/2基学意义(P＜0．01)。结论:胃泌素能够通过EＲK因在胃泌素促进大肠癌细胞株CACO2增殖中的信号通路促进体外大肠癌CACO2细胞增殖。通作用及分子机制。方法:通过慢病毒感染细胞构

2、过ＲNA干扰技术有效地阻断EＲK信号通路下调建胃泌素受体(CCK-BＲ)阳性的细胞稳转株CA-EＲK蛋白磷酸化水平，有望为胃泌素依赖型大肠CO2，应用qＲT-PCＲ检测大肠癌细胞株CACO2癌综合治疗寻找到一条新的切入途径。中CCK-BＲ的表达情况。应用ＲNA干扰技术沉关键词胃泌素;EＲK1/2;大肠癌;ＲNA干扰;慢默EＲK1/2基因后，分析其总的EＲK基因的蛋白病毒感染表达及其磷酸化水平变化。实验共分4组:对照组、阴性干扰组、胃泌素组及质粒干扰组。使用流中图分类号:Ｒ965．2;Ｒ73-3式细胞仪AnnexinV-FITC法检测各组细胞增殖

3、文献标志码:A指数及Westernblot检测各组细胞EＲK1/2蛋白文章编号:1009-2501(2017)04-0401-05的表达和磷酸化水平。结果:慢病毒感染后，在CACO2细胞中均检测到目的条带膜蛋白，CACO2近年来的研究结果表明，细胞外信号调节蛋细胞存在着一定量的CCK-BＲmＲNA表达，扩增白激酶(extracellular-signalregulatedproteinki-产物为185bp。筛选出干扰质粒，质粒与脂质体nase，EＲK)传导通路参与了胃泌素对大肠癌细胞比例在1∶2，转染效率达到40%～50%，转染干扰生长的调控

4、，但具体分子机制仍不清楚。本研究质粒的细胞中EＲK蛋白表达水平降低，从蛋白水通过慢病毒感染细胞构建胃泌素受体(CCK-BＲ)平说明构建的质粒沉默有效。胃泌素组细胞增殖阳性的细胞稳转株CACO2，以EＲK的mＲNA为指数明显高于质粒干扰组，也高于阴性干扰组和靶基因，设计合成短发夹ＲNA(shＲNA)构建干扰空白对照组，差异有统计学意义(P＜0．01)。4组质粒，并将其转染到胃泌素高表达大肠癌细胞稳细胞间EＲK1/2的蛋白表达及磷酸化水平比较，转株CACO2中，观察各组大肠癌细胞CACO2中差异有统计学意义(P＜0．01)。胃泌素组EＲK1/EＲK

5、1/2蛋白表达的情况，明确胃泌素与EＲK1/22的蛋白表达及磷酸化水平明显高于质粒干扰相关性，进一步证实胃泌素能够通过EＲK1/2信组，也高于阴性干扰组和空白对照组，差异有统计号通路促进大肠癌细胞增殖。1材料与方法2017-03-03收稿2017-03-23修回安徽省自然科学基金资助项目(1408085MH148);皖南医学院弋1．1主要材料人大肠癌CACO2细胞株购自中矶山医院人才引进基金(YＲ201406)茆家定，男，博士，主任医师，硕士生导师，研究方向:胃肠激素与国科学院上海生命科学研究院;五肽胃泌素购自消化道肿瘤。中国Biosharp生

6、物科技公司;Actin抗体及West-E-mail:maojiading0205@sina．comernblot细胞裂解液购自中国碧云天生物技术研究所;EＲK1/2及磷酸化EＲK1/2兔抗人多克隆·402·ChinJClinPharmacolTher2017Apr;22(4)抗体购自美国CST公司;EＲK1/2干扰质粒购自药物100μL。每组各设5个复孔，继续培养48上海吉凯基因公司;噻唑兰(MTT)购自美国Sig-h。结束培养，用0．25%胰蛋白酶消化，4℃、ma公司;底物显色试剂购自美国Millipore公司;12000×g离心10min，

7、弃上清液。加入1mL冷磷酸酶抑制剂、细胞周期检测试剂盒购自中国凯的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，重复清洗3次，将基生物科技发展有限公司;逆转录试剂盒购自美细胞重悬于200μL结合缓冲液，吹打均匀后缓慢国Fermentas公司;Trizol试剂购自美国Invitrogen滴入1mL70%乙醇固定，进行DNA、蛋白质染公司;所有引物由上海生工生物工程股份有限公色，上机进行流式细胞仪测定，计算细胞增殖指司合成。数。1．2细胞培养和慢病毒感染将CACO2细胞复1．5qＲT-PCＲ检测细胞稳转株CACO2内苏培养，当培养瓶中80%以上长满CACO2细胞CC

8、K-BＲmＲNA表达总ＲNA提取和cDNA合即进行传代。取对数生长期细胞消化离心，加入成具体步骤参照文献报道。胃泌素/胆囊收缩素预先配制好的冻存液吹打