ERK信号传导通路在滋养层细胞侵袭过程中的作用

《ERK信号传导通路在滋养层细胞侵袭过程中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、博士学位论文ERK信号传导通路在滋养层细胞侵袭过程中的作用博士研究生：张曦倩指导教师：邢福祺摘要胚泡着床及胎盘形成是极其复杂的生理过程，这一过程顺利完成依赖丁-滋养层细胞的侵润。滋养层细胞具有侵袭性，这一点与肿瘤细胞的侵袭转移极其相似，在胎盘形成后，滋养层细胞的侵袭行为便先行终止，这又与肿瘤细胞的侵袭完全不同，即所谓滋养层细胞侵入的节制性。滋养层细胞的侵入过程是受到机体严格的精细调控的，调节失控就会导致病变，其中滋养层细胞过度的侵入与多种妊娠滋养细胞疾病(如绒毛膜癌等)形成有关，而侵入不足则会造成自然流产、宫内发

2、育迟缓、先兆子痫等。因此，阐明滋养层细胞的侵袭机制将为防治滋养层细胞侵入异常相关的疾病提供理论基础。滋养层细胞的侵袭行为小仅受到自身所分泌的某些物质调节，同时受到蜕膜组织中细胞所分泌的物质及其细胞外基质(extraceUularmatrix，ECM)的调控。现已证实，ECM能通过与滋养层细胞膜上相应受体整合素(integrin)结合，以介导滋养层细胞的粘附、迁移、侵入等过程。然而，在滋养层细胞侵袭过程中，ECM通过integrin究竟启动细胞内的哪些信号传导机制目前仍末阐明。整合素可将胞外的ECM分子与细胞内的骨

3、架蛋白连接起来形成焦点粘附物，焦点粘附物是整合素信号传导的结构基础。粘着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)是首次从焦点粘附物中鉴定出来而命名的蛋闩激酶，它在整合素介导的信号传导途径中起着关键作用。最近文献报道，FAK可能参与滋养层细胞侵袭能力的调节。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular—signalregulatedproteinkinase，ERK)是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导蛋白激酶，调节着多种细胞的生长、分化、迁移、侵袭等多种过程。本课题组先前研究表

4、明，ERK能够调节滋养层细胞多种侵袭相关基因的表达(如MMP9、MMP2等)，以影响其侵入。研究发现，多种整合素能通过FAK依赖性的或非依赖性的方式激活ERK。在肿瘤细胞方面，研究发现ECM能通过与细胞膜上相应受体inte鲫n摘要结合，激活胞浆内FAK，启动ERK信号传导通路，以介导多种肿瘤细胞的迁移、侵袭过程。这提示ECM可能通过integrin激活细胞内FAK、ERK信号传导通路参与滋养层细胞侵袭{J二为的调节。本课题应用绒毛外细胞滋养层细胞(extravillouscytolrophoblasts，EVCT

5、)体外侵袭模型，以Malrigel模拟细胞外基质(ECM)，探讨了上述信号传导通路在滋养层细胞侵袭过程中的作用，发现ERK信号通路对滋养层细胞侵袭行为有着重要的调节作用，并进一步筛选出滋养层细胞侵袭过程中ERK通路相关的调节基因。第一部分绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)体外侵袭模型的建立【目的】建立EVCT体外侵袭模型，为探讨滋养层细胞侵袭调节机制提供实验平台。【方法】1．绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)体外侵袭模型的建立本实验用0．125％胰蛋白酶和50Kunitz／mlDNA酶，温和消化绒毛块，分离滋养层细胞

6、，用不连续密度Percoll梯度纯化滋养层细胞，然后再用贴壁分离法去除成纤维细胞、巨噬细胞等，进、步纯化绒毛外滋养层细胞，按所需浓度接种于涂有Matrigel培养板或24孔Transwell侵入系统中培养。2．用细胞免疫荧光法检测TGFl32、cytokerafion7、integrin0【16l。3．用CCK．8评价细胞生长状况将每孔2x104个EVCT细胞接种在Matrigel包被96孔培养板，将EVCT置于细胞培养箱中37℃0．05C02培养0、24h、48h、72h不同时间后，分别每孔加入lOglCCK一

7、8，继续培养4h，用酶联检测仪测450nm波长，参比波长为600rim，测定吸光度OD值，观察体外培养EVCT生长的影响。4．用Transwell细胞侵入系统检测EVCT的体外侵袭作用将每孔lxl05个EVCT细胞接种在24孔Transwell侵入系统l：室中，置于细胞培养箱中37℃O．05C02培养24h、48h、72h后，应用CCK一8检测侵入细胞情况。【结果】1．EVCT在Matrigel包被的Petri皿培养4h，用细胞免疫荧光法显示有95％一II博士学位论文以上的细胞表达TGFJ32、cytokerat

8、ion7，integrina1131。2．EVCT在Matfigel培养0、24h、48h、72h不同时间后，生长指数分别为100、104_+10、102_+6、99a：7，提示Matrigel对EVCT的生长未见明显影响。3．EVCT在Transwell侵袭系统中培养24h、48h、72h不同时间后，侵袭细胞的OD分别为0．125-+0．008、0．163-+0．010