果蝇钠通道DmNav22在双氧木脂素A作用机理研究中的应用.pdf

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1、西北农业学报２０１７，２６（４）：６３５－６４０ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＢｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓＳｉｎｉｃａｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１７．０４．０２０网络出版日期：２０１７－０３－３０网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１７０３３０．１５０９．０４０．ｈｔｍｌ果蝇钠通道ＤｍＮａｖ２２在双氧木脂素Ａ作用机理研究中的应用闫秀芳，郄杏桃，吴文君，胡兆农（１．西北农林科技大学植物保护学院农药研究所，陕西杨凌７１２１００；２

2、．西北农林科技大学陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西杨凌７１２１００）摘要建立以爪蟾卵母细胞为载体的果蝇钠通道表达系统，研究双氧木脂素Ａ的杀虫分子机理。将果蝇钠通道ＤｍＮａｖ２２与ＴｉｐＥ亚基基因分别进行体外转录，获得ＤｍＮａｖ２２与ＴｉｐＥ亚基基因的ｃＲＮＡ，将Ｄｍ－Ｎａｖ２２与ＴｉｐＥ的ｃＲＮＡ等质量混合，显微注射至新鲜的非洲爪蟾卵母细胞，在ＮＤ９６溶液、１８℃培养１２～１８ｈ后采用双电极电压钳技术记录其电流，测定双氧木脂素Ａ对钠电流的影响。结果表明，注射ｃＲＮＡ的非洲爪蟾卵母细胞，可记录到明显的果蝇钠通道电压门控内向电流，未注

3、射的对照组细胞则未记录到钠电流；双氧木脂素Ａ使钠通道失活电压依赖性向超极化方向移动。说明，果蝇钠通道在非洲爪蟾卵母细胞中成功表达，为进一步研究双氧木脂素Ａ的作用机理奠定基础。关键词果蝇钠通道；双电极电压钳；非洲爪蟾卵母细胞；双氧木脂素Ａ中图分类号Ｓ４８１文献标志码Ａ文章编号１００４－１３８９（２０１７）０４－０６３５－０６［１３］电压门控钠通道在电信号传递中起着关键作者Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等从草本植物透骨草（Ｐｈｒｙｍａ［１］用，是许多天然神经毒素的靶标。昆虫钠通道ｌｅｐｔｏｓｔａｃｈｙａＬ．）中分离鉴定的一个二氧双环辛［１３］结构和哺乳动物

4、相似，也由４个高度同源的结构烷木脂素类化合物。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等和肖新敏［１４－１６］域（ＤＩ－ＤＩＶ）组成，每个结构域均含有６个跨膜等的杀虫活性测定表明，ＨＡ具有超高的杀［２－３］α－螺旋片段（Ｓ１－Ｓ６）。昆虫第１个钠通道基因虫活性，与合成拟除虫菊酯类杀虫剂的杀虫活性是从果蝇的温度敏感突变体克隆的ｐａｒａ基因处于同一水平。关于ＨＡ的杀虫作用机理，Ｈｕ［４］［１７］（命名为ＤｍＮａｖ）。ＴｉｐＥ是昆虫钠通道的一等初步研究表明，ＨＡ能引起钠通道失活曲线个调节亚基基因，将ｐａｒａ与ＴｉｐＥ共同表达在爪显著地向超极化方向移动，推测其作用于电压

5、门蟾卵母细胞中不仅增强了表达的丰度，而且发现控钠通道。然而，ＨＡ作用钠通道的机理及其作在不影响钠电流的时间和电压依赖性下，锋电流用位点如何，尚需进一步的研究。因此，本试验建［５－６］增大，失活加快。立以非洲爪蟾卵母细胞为载体的果蝇钠通道表达非洲爪蟾卵母细胞被广泛用于各型离子通道系统，初步探讨ＨＡ对昆虫钠通道作用的浓度效和受体的异源表达，用以研究受体及离子通道的应，旨在为进一步研究ＨＡ的杀虫作用机理奠定生理学和药理学特性，或探讨药物的作用机制和基础。［７］作用靶标。迄今，已有４种ＤｍＮａｖ同源基因１材料与方法在非洲爪蟾卵母细胞中功能性表达，即

6、家蝇的［８］［９－１０］Ｖｓｓｃ１、德国小蠊的ＢｇＮａｖ、瓦螨的Ｖｍ－１．１供试材料［１１］［１２］Ｎａｖ和黄热病蚊伊蚊的ａＮａｖ基因。但在国双氧木脂素Ａ（ＨＡ）：从透骨草中分离获得，内，爪蟾卵母细胞表达体系在昆虫钠通道研究方纯度（质量百分数）≥９８％。其分子式Ｃ３３Ｈ３４Ｏ１４，［１３］面的应用较少。相对分子质量６５４，结构如图１。将ＨＡ溶于双氧木脂素Ａ（ｈａｅｄｏｘａｎＡ，ＨＡ）是日本学ＤＭＳＯ中制备成３０ｍｍｏｌ／Ｌ的母液，４℃储存备收稿日期：２０１６－０３－１６修回日期：２０１６－０５－０８基金项目：国家自然科学基金（３１６７２０５

7、５）；陕西省农业科技创新与攻关（２０１５ＮＹ０３３）。第一作者：闫秀芳，女，硕士研究生，从事农药毒理学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｕｆａｎｇｙａｎ＠１６３．ｃｏｍ通信作者：胡兆农，男，博士，教授，博士生导师，主要从事农药毒理学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕｚｈａｏｎｏｎｇ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ·６３６·西北农业学报２６卷用，试验时将其溶解于相应的ＮＤ９６溶液中稀释３７℃培养箱中培养１７～２４ｈ，挑选单克隆置于液得到所需药物终浓度。体ＬＢ培养基中，２５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１２～１６ｈ，菌种、质粒、试验动物及培养基：大肠杆菌提取质粒，经双酶切鉴定正

8、确后，送上海立菲生物Ｓｔｂｌ３购自广州易锦生物技术有限公司；携带测序有限公司鉴定，测序结果与已知数据比对正ＤｍＮａｖ２２、ＴｉｐＥ编码序列的质粒由美国密歇根确。取ＤｍＮａｖ２２和