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1、牛蒡子木脂素成分的抗肿瘤作用和机理研究癌症是全世界范围内的一个主要的健康问题。因为有些肿瘤患者死于对现有的抗癌药物不敏感,或者在经过一定时间的治疗,对已有药物产生耐药性,所以在目前,研究和开发新的抗癌疗法和抗癌药物是有价值和迫切需要的。本论文的研究目的是在天然产物中发现抗癌的先导化合物并研究其体内和体外的作用效果和机理。背景与目的根据现有文献和我们以前的实验结果数据显示,在中药牛蒡子中,两个木脂素类化合物牛蒡子苷元和牛蒡子苷发现对一系列肿瘤细胞具有抗肿瘤作用。牛蒡子苷元,牛蒡的种子中发现的一种活性化合物,可以根除缺乏营养的肿瘤细胞。在除了它对不同肿瘤细
2、胞株的广谱抗肿瘤活性结果,例如胰腺癌细胞系PANC-1和AsPC-1,牛蒡子苷元对于在葡萄糖剥夺条件下的癌细胞表现出一个高选择性细胞毒作用[91]。牛蒡子中的拉帕酚B,拉帕酚A和异拉帕酚A对于白血病K562细胞的IC50分别为38.5μg/ml,53.5μg/ml,51.1μg/ml[137]。因此,研究牛蒡子中木脂素类化合物的抗肿瘤活性及作用机理,从而发现安全有效地抗肿瘤先导化合物仍具有十分重要的意义。方法(1)牛蒡子提取物氯仿部位经由正相硅胶,SephadexLH-20凝胶色谱,ODS-B反相硅胶色谱分离出牛蒡子苷,牛蒡子苷元和LappaolF。用
3、波谱解析的方法,对其结构进行了鉴定。对所有分离的化合物的光谱数据进行了测定;在TU-1901紫外光谱仪(普析通用,中国)上测定紫外吸收光谱;在API2000的LC/MS/MS测量设备测定电喷雾电离-质谱(ESI-MS);在Brukerdrx-400记录1H和13C核磁共振谱(NMR),以四甲基硅烷(TMS)仪器使用作为内标。(2)牛蒡子苷元,牛蒡子苷,和LappaolF,采用MTT法和平皿克隆法对肿瘤细胞株进行药效学检测。通过流式细胞仪测定细胞周期。蛋白质印迹法法分析研究化合物作用机理。(3)在HeLa肿瘤细胞荷瘤裸鼠体内对LappaolF,牛蒡子苷和
4、牛蒡子苷元进行药效学试验。结果1.牛蒡子中木脂素类化合物的制备。通过各种色谱方法分离得到牛蒡子中的三个化合物,1-3。通过光谱解析,结合化合物的薄层层析结果和紫外光谱数据,与文献1H和13CNMR数据比较,化合物1-3分别被确定为牛蒡子苷元,LappaolF和牛蒡子苷。通过戴安P680型高效液相色谱仪进行纯度测定。测定条件:PDA-100二极管矩阵检测器设定吸收波长为280nm。色谱柱为菲罗门Luna,柱长4.6x150mm,柱填料孔径5μm,柱温35℃,甲醇和水为流动相,比例为47%的甲醇和53%水(体积/体积),流速1.0mL/min。Lappao
5、lF的出峰时间在15.93分钟。2.牛蒡子木脂素的体外抗肿瘤药效学研究LappaolF呈时间和剂量依赖性抑制肿瘤细胞增殖,对MCF-7,MDA-MB-231和RKO细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为13.3,16.8和25.2μM。同时,LappaolF对人正常乳腺MCF-10A细胞,3天或治疗时间延长到6天处理时表现出极小的细胞毒性。3.LappaolF的抗肿瘤作用机制.流式细胞仪分析结果表明,LappaolF显著增加了2NG1期细胞比例或4NG2/M期细胞比例。在MCF-7和HeLa细胞中,细胞主要被主要阻滞在2NG1期。实验结果显示,Lappa
6、olF处理的MCF-7细胞中在G1期观察到的数量显著的增加(从65%到87%);LappaolF处理的HeLa细胞中在G1期观察到的数量显著的增加(从56%至67%)。同时,LappaolF处理的HeLa细胞中在G1前期观察到的数量也显著的增加(从1%至15%)。在MDA-MB-231和RKO细胞中,细胞主要被主要阻滞在4NG2/M期。实验结果显示,LappaolF处理的MDA-MB-231细胞中在G2期观察到的数量显著的增加(从21%到45%);LappaolF处理的RKO细胞中在G2期观察到的数量显著的增加(从19%到71%)。研究结果表明,Lap
7、paolF的分子机制是通过调节细胞周期依赖蛋白阻滞剂的表达水平来诱导细胞周期阻滞。实验显示,LappaolF处理的MCF-7细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而CDK2,cyclinB和CDK1的水平都显著下降。LappaolF处理的HeLa细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而cyclinB和CDK1的水平都显著下降。LappaolF处理的MDA-MB-231细胞,CDK抑制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而CDK2,cyclinB和CDK1的水平都显著下降。LappaolF处理的RKO细胞,CDK抑
8、制剂p21和p27蛋白的表达水平明显升高,而cyclinB和CDK1的水平都显著下降。机理研究
