猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立.pdf

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1、动物医学进展，２０１７，３８（４）：２８－３４ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ猪瘟病毒石门株ＮＳ３蛋白的原核表达及其抗体检测间接ＥＬＩＳＡ的建立陆欣然，华思红，樊钰莹，白文顺，杜敏，孙永科，杨玉艾＊（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１）摘要：为配合猪瘟新型疫苗的研发，建立了猪瘟病毒ＮＳ３蛋白抗体检测间接ＥＬＩＳＡ，以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪（包括常规疫苗接种猪）的目的。以接种猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）石门株的ＰＫ－１５细胞为模板提取总ＲＮＡ，经特异性ＰＣＲ扩增获得长度为２０４９ｂｐ的ＣＳＦＶＮＳ３基因，

2、将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋），在大肠埃希菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中优化表达ＣＳＦＶ石门株ＮＳ３基因。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明重组蛋白ＮＳ３具有反应原性。将纯化的重组蛋白ＮＳ３作为包被抗原建立检测ＣＳＦＶＮＳ３抗体的间接ＥＬＩＳＡ，以美国爱德士（Ｉｄｅｘｘ）猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准，对５０２份血清样品进行检测。结果表明，所建立方法的特异性为９６．９％，敏感性为８９．７％，总符合率为９５．８％，为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。关键词：猪瘟病毒；ＮＳ３基因；原核表达；蛋白纯化

3、；间接ＥＬＩＳＡDOI:10.16437/j.cnki.1007-5038.2017.04.006中图分类号：Ｓ８５２．６５１文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１７）０４－００２８－０７猪瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ，ＣＳＦ）是由猪瘟病达Ｅ２和Ｅ０蛋白，并非全病毒，即可利用针对ＮＳ３毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）引发的一种重组蛋白的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒来区分全病毒（包括［１］高传染性、高致死性猪传染病，给养猪业造成了严疫苗毒和野毒）和猪瘟重组腺病毒疫苗（ｒＡｄ－Ｅ０－Ｅ２）重危害。世界动物卫

4、生组织（ＯＩＥ）将其列入必须报激发机体产生的抗体。告的动物疫病，我国也将其列为一类动物传染病。本研究将猪瘟病毒石门株ＮＳ３基因克隆到插猪瘟在我国各地猪群中都有存在，呈现地区性散发入了自聚集自切割功能内含肽的原核表达载体性特点，猪群中存在一定隐性感染和持续性感染现ｐＥＴ－３２ａ（＋）中构建重组质粒，然后在大肠埃希菌［２－５］象。Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）菌中进行优化表达，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥＣＳＦＶ为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组约１２．３和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ析重组蛋白。将纯化的重组蛋白ｋｂ，两端为非编码区（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，ＮＣＲ）５－ＮＳ

5、３作为包被抗原，建立间接ＥＬＩＳＡ，将检测结果ＮＣＲ和３－ＮＣＲ［６］，中间存在一个开放性阅读框与Ｉｄｅｘｘ公司生产的ＣＳＦＶ－Ａｂ检测试剂盒检测结（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），从Ｎ端到Ｃ端依次分果进行对比。该方法不仅可以区分全病毒（包括疫别为：Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅ０、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、苗毒和野毒）和重组腺病毒（ｒＡｄ－Ｅ０－Ｅ２）感染的猪［７－９］。猪瘟病毒非结构蛋白群，极大地促进ＣＳＦＶ的净化或根除，而且该方法是ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ和ＮＳ５Ｂ利用自切割自聚集功能的融合标签表达、纯化重组ＮＳ３高度保守，具有丝氨酸蛋

6、白酶、核苷三磷酸酶和［１０］蛋白，无需使用昂贵的亲和纯化柱来纯化蛋白，大大ＲＮＡ解旋酶活性，是病毒复制增殖的必需蛋白。降低了实验成本并可规模化生产，具有重要的应用ＮＳ３和Ｅ０、Ｅ２均为ＣＳＦＶ主要抗原蛋白，可以诱导前景。机体产生抗体，通过检测猪体内ＮＳ３抗体水平可以［１１－１３］１材料与方法反映ＣＳＦＶ在体内感染状况。为了与猪瘟病毒Ｅ２和Ｅ０基因工程疫苗的快速发展相适应，需要建１．１材料立一套与之相匹配的用于鉴别诊断野毒感染和疫苗１．１．１ＣＳＦＶ、表达载体、菌株、阴阳性血清ＣＳ－免疫接种猪的血清学检测方法。如果猪只免疫仅表ＦＶ毒株为猪瘟病毒石门株；培

7、养细胞为ＰＫ－１５细收稿日期：２０１６－１０－２８基金项目：国家自然科学基金项目（３１５６０７０４）；云南农业大学自然科学基金项目（２０１６ＺＲ１２）作者简介：陆欣然（１９８９－），女，天津人，硕士研究生，主要从事动物医学方向研究。＊通讯作者陆欣然等：猪瘟病毒石门株ＮＳ３蛋白的原核表达及其抗体检测间接ＥＬＩＳＡ的建立２９胞；ｐＥＴ－３２ａ（＋）原核表达载体，本云南农业大学动ＤＨ５α感受态细包中，然后ＰＣＲ、酶切鉴定。将鉴定科院病毒室保存；大肠埃希菌ＤＨ５α和Ｒｏｓｅｔｔａ正确的克隆送至上海英俊生物技术公司进行测序。（ＤＥ３）菌株感受态细胞，本实验室制备

8、保存；ＣＳＦＶ１．２．２重组蛋白ＮＳ３的诱导表达与纯化将鉴定ＮＳ３阴阳性血清，购自泉州市蓝图生