蓝舌病病毒vp7蛋白、施马伦贝格病毒n蛋白的原核表达及间接elisa检测方法的建立

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：2012613硕士学位论文蓝舌病病毒VP7蛋白、施马伦贝格病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立ProkaryoticExpressionofBluetongueVirusVP7Protein,SchmallenbergVirusNProteinandDevelopmentofIndirectELISA作者姓名：王贞钧学位类别：农学硕士专业名称：临床兽医学研究方向：现代兽医临床诊疗新技术指导教师：王全凯教授贾赟高级兽医师所在学院：动物科学技术学院20

2、15年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文

3、的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者

4、签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要蓝舌病（Bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）引起的一种烈性非接触性传染病。BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属(Obivirus)蓝舌病病毒亚群，主要侵害纯种细毛羊。该病毒是由10个片段组成的双股RNA病毒，共编码7种结构蛋白（VP1~VP7）和5种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3a、NS4）。其中VP7蛋白携带群特异性抗原决定簇，至少含有6个线性抗原表位，通过对不同血清型VP7蛋白的

5、氨基酸序列比对得出，30~48位氨基酸残基的序列同源性为100%，证明VP7蛋白为高度保守的蛋白，具有群特异性，是BTV抗体检测的理想抗原。施马伦贝格病是由施马伦贝格病毒（Schmallenbergvirus，SBV）引起的经库蠓传播的一种新型病毒性传染病。SBV是由3个片段组成的单股负链RNA，属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）辛波血清群病毒（Simbuserogroupviruses），此病蔓延于西欧大部分地区，我国目前尚未出现此病。在施马伦贝格病毒编码的

6、蛋白中，核衣壳N蛋白抗原性最强，因此N蛋白成为研究热点。本研究为了建立BTV-VP7ELISA检测方法，根据GenBank中BTV25型毒株的VP7基因序列（登录号EU839843.1）设计一对引物，以含VP7基因的重组质粒为模板，利用PCR方法扩增出BTV25型毒株的VP7目的基因，克隆至pET-24b(+)表达载体中，获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经核苷酸序列测定，将正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达纯化His-BTV-VP7蛋白，以此蛋白作为包被抗原建立间接ELIS

7、A检测方法。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定表明，VP7蛋白以包涵体形式表达，分子量大小与预期相符。ELISA优化结果表明，抗原80倍稀释、山羊阳性血清400倍稀释、HRP标记的驴抗山羊IgG5000倍稀释为最佳稀释度。利用该方法与IDEXX蓝舌病毒VP7抗体检测试剂盒检测结果对比，二者一致性超过94%；检测其他4种病毒阳性血清，结果均为阴性。说明建立的此法敏感性高、特异性强可以用于蓝舌病的流行病学调查，且成本低。由于施马伦贝格病毒是外来病毒，我国尚未出现此病毒株，也没有出现感染病例，所以本研究为了建

8、立SBV-NELISA检测方法，根据GenBank公布的SBV（BH80/11-4）碱基序列，利用基因合成的方法获得SBV-N蛋白的基因，克隆至pET-24b(+)表达载体中，获得pET-24b-SBV-N重组质粒。经核苷酸序列测定，将正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达纯化His-SBV-NI蛋白。经SDS-PA