临床医学毕业论文羊软骨ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定.doc

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1、毕业论文羊软骨II型胶原蛋白的提取纯化与鉴定2014年6月25日羊软骨n型胶原蛋白的提取纯化与鉴定作者：肖旭，石文达，姚青，陈虎，王基云，李晓兵，高岭【摘要】H的从羊肋软骨屮提取纯化II型胶原蛋白，并对其进行鉴定。方法选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后，用盐酸弧去除蛋白多糖，经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤，提取纯化蛋白，然后进行鉴定。结果4mol/L盐酸弧能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意；氯化钠盐析浓度为3mol/L吋最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的蛋白与Sigma公司的II型胶原蛋白一致。II型胶原蛋白最大吸

2、收峰为212nmo结论从羊肋软骨提取的II型胶原蛋白纯度高，且符合II型胶原蛋白的特征。【关键词】II型胶原蛋白；软骨；蛋白多糖Abstract:ObjectiveToisolateandpurifycollagentypeII(CII)fromSheepcartilageandtoidentifyitspurity.MethodsTheSheepcartilageswerecollectedasrawmaterials.Afterdegreasinganddecalcification,Guanidinehydrochloridewasu

3、sedtoremovetheproteoglycans.Thedigestionofpepsin,saltingofsodiumchloridewereperformedforextractingCIIandidentification.ResultsTheproteoglycanscouldbeefficientlyremovedby4mol?LIguanidinehydrochloride.Theresultswereobtainedbylimitedenzymedigestionofpepsinadded.Theoptimizingc

4、oncentrationofsodiumchlorideforsaltingC11was3mol?L1.ItwasfoundthattheproteinandSigmaCIIwereatthesamelocationbySDSPAGE.Theabsorptionpeakwasat212nm.ConclusionTheCIIisolatedfromSheepcartilagehashighpurityandaccordswiththecharacteristicsofCollagentypeII.Keywords:collagentype11

5、;cartilage;proteoglycansII型胶原蛋白（collagentypeII,CII）是软骨基质的主要有机成分，是关节软骨屮主要的细胞外间质之一。近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与CII自身免疫反应有关［1-3］,口服CII诱导免疫耐受对类风湿性关节炎（RheumatoidArthritis,RA）有显著的疗效［4］。对于胶原蛋白的提取Fl前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在很大的差别：5-8］o本研究选择宁夏富有的绵羯羊肋软骨为原料，来制备较高纯度的II型胶原，报告如下。1实验材料和方法1.1主要试剂和耗材胃蛋

6、白酶（Amresco公司）；盐酸呱（Amresco公司）；牛II型胶原蛋白参照品（C7806Sigma公司）；46〜200kD蛋白质分子量标志物（宋生物工程有限公司），阴离子交换载体（DEAE32上海试剂二厂），透析袋（德国SercaFeinbiochemica公司）,余试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器电泳仪（Bio-Rad公司）；凝胶全自动图像分析系统（Bio-Ra公司）；冷冻离心机（日立公司CF16RX）；酸度计（梅特勒■托利多仪器有限公司）；电子天平（梅特勒■托利多仪器有限公司）；721分光光度i+（Varian公司）；LL-300

7、0型冷冻干燥机（ThermoElectronCorporation）o1.3方法1.3.1胶原蛋白的提取从新鲜的羊肋软骨屮切取透明软骨，剥去骨膜，去除骨化部分，用生理盐水洗净，切成0.5mm左右的薄片，液氮冷冻粉碎后称重，按照软骨量加入5倍体积的脱脂液（氯仿：甲醇：水=1:2:0.8）在4°C下搅拌脱脂48h,期间每8h更换脱脂液直到脱脂完全，在同样温度和搅拌条件下用10倍体积的0.1mol/L盐酸进行脱鈣处理48h,直到软骨变柔软，离心去除脱钙液，按照每克软骨加入10倍体积的4mol/L盐酸弧，于4°C搅拌48h,12000g离心20mi

8、n,沉淀用Tris-HCl（pH7.4）缓冲液和0.5mol/L乙酸充分洗涤后，用5倍体积的胃蛋白酶消化液（0.5mol/L乙酸配成lg/L）混悬，4°C下搅拌24h,12000