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时间:2019-11-22
《临床医学毕业论文羊软骨ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、XX大学毕业论文羊软骨II型胶原蛋白的提取纯化与鉴定2014年6月25日羊软骨II型胶原蛋白的提取纯化与鉴定作者:肖旭,石文达,姚青,陈虎,王基云,李晓兵,高岭【摘要】口的从羊肋软骨屮提取纯化II型胶原蛋白,并对其进行鉴定。方法选择羊肋软肯为原料经脱脂、脱钙后,用盐酸弧去除蛋口多糖,经胃蛋□酶消化、氯化钠盐析等步骤,捉取纯化蛋白,然后进行鉴定。结果4mol/L盐酸肌能有效去除蛋口多糖,用胃蛋口酶的限制性酶解结杲满意;氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳。SDS-PAGE屯泳结果显示提取纯化的蛋片与Sigma公司的II型
2、胶原蛋白一致。II型胶原蛋白最大吸收峰为212nmo结论从羊肋软骨提取的II型胶原蛋白纯度高,且符合II型胶原蛋口的特征。【关键词】II型胶原蛋口;软骨;蛋口多糖Abstract:ObjectiveToisolateandpurifycollagentypeII(CII)fromSheepcartilageandtoidentifyitspurity.MethodsTheSheepcartilageswerecollectedasrawmaterials.Afterdegreasinganddecalcificati
3、on,Guanidinehydrochloridewasusedtoremovetheproteoglycans.Thedigestionofpepsin,saltingofsodiumchloridewereperformedforextractingCIIandidentification.ResultsTheproteoglycanscouldbeefficientlyremovedby4mol?L1guanidinehydrochloride.Theresultswereobtainedbylimiteden
4、zymedigestionofpepsinadded・TheoptimizingconcentrationofsodiumchlorideforsaltingCIIwas3mol?L1.ItwasfoundthattheproteinandSigmaCIIwereatthesamelocationbySDSPAGE.Theabsorptionpeakwasat212nm.ConclusionTheCIIisolatedfromSheepcartilagehashighpurityandaccordswiththech
5、aracteristicsofCollagentypeII.Keywords:collagentypeII;cartilage;proteoglycansI【型胶原蛋fl(collagentypeII,CII)是软骨基质的主耍有机成分,是关节软骨中主要的细胞外间质之一。近年來研究表明,类风湿性关节炎的发病与CII自身免疫反应有关[1-3],口服CII诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis,RA)有显著的疗效[4]。对于胶原蛋口的提取目前所报道的方法,操作复杂,条件不一,结果存在很大的差别
6、[5-8]o本研究选择宁夏富冇的绵羯羊肋软骨为原料,来制备较高纯度的I【型胶原,报告如21实验材料和方法1.1主要试剂和耗材胃蛋白酶(Amresco公司);盐酸弧(Amresco公司);牛II型胶原蛋白参照M(C7806Sigma公司);46〜200kD蛋白质分子量标志物(宝生物工程有限公司),阴离子交换载体(DEAE32上海试剂二厂),透析袋(徳国SercaFeinbiochemica公司),余试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器电泳仪(Bio-Rad公司);凝胶全自动图像分析系统(Bio-Ra公司);冷冻离心机(日
7、立公司CF16RX);酸度计(梅特勒■托利多仪器冇限公司);电子天平(梅特勒■托利多仪器有限公司);721分光光度i
8、(Varian公司);LL-3000型冷冻干燥机(ThermoElectronCorporation)。1.3方法1.3.1胶原蛋口的提取从新鲜的羊肋软骨屮切取透明软骨,剥去骨膜,去除骨化部分,用生理盐水洗净,切成0.5mm左右的薄片,液氮冷冻粉碎后称重,按照软骨量加入5倍体积的脱脂液(氯仿:甲醇:水=1:2:0.8)在4°C下搅拌脱脂48h,期间每8h更换脱脂液直到脱脂完全,在同样温度和搅拌条件下用
9、10倍体积的O.lmol/L盐酸进行脱钙处理48h,直到软骨变柔软,离心去除脱钙液,按照每克软骨加入10倍休积的4mol/L盐酸呱于4°C搅拌48h,12000g离心20min,沉淀用Tris-HCI(PH7.4)缓冲液和0.5mol/L乙酸充分洗涤后,用5倍体积的胃蛋白酶消化液(0.5mol/L乙酸配成lg/L)混悬,4°C下搅拌24h,12
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