羊软骨ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

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1、万方数据·730·宁夏医科大学学报JoumalofNingxiaMedicalUniversity第31卷6期2009年12月文章编号：1674—6309(2009)06—0730—02羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定·论著·肖旭1，石文达2，姚青1，陈虎1，王基云1，李晓兵1，高岭1(1．宁夏医科大学，银川750004；2．承德医学院附属医院，承德067000)摘要：日曲从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白，并对其进行鉴定。方法选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后，用盐酸胍去除蛋白多糖，经胃蛋白酶消化、氯

2、化钠盐析等步骤，提取纯化蛋白，然后进行鉴定。结摹4moVL盐酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意；氯化钠盐析浓度为3moVL时最佳。SDS—PAGE电泳结果显示提取纯化的蛋白与Sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致。Ⅱ型胶原蛋自最大吸收峰为212nln。结论从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高，且符合Il型胶原蛋白的特征。关键词：Ⅱ型胶原蛋白；软骨；蛋白多糖中图分类号：Q51文献标识码：AⅡ型胶原蛋白(collagentypeII，C1I)是软骨基质的主要有机成分，是关节软骨中主要的细胞外间

3、质之一。近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与ClI自身免疫反应有关【“引，口服cⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis，RA)有显著的疗效[4]。对于胶原蛋白的提取目前所报道的方法，操作复杂，条件不一。结果存在很大的差别拍。8】。本研究选择宁夏富有的绵羯羊肋软骨为原料，来制备较高纯度的Ⅱ型胶原，报告如下。1实验材料和方法1．1主要试剂和耗材胃蛋白酶(Amr；e∞o公司)；盐酸胍(Amresco公司)；牛Ⅱ型胶原蛋白参照品(C7806Sigma公司)；46—200kD蛋

4、白质分子量标志物(宝生物工程有限公司)，阴离子交换载体(DEAE32上海试剂二厂)，透析袋(德国SercaFeinbiochemica公司)，余试剂均为国产分析纯。1．2主要仪器电泳仪(Bio—Pad公司)；凝胶全自动图像分析系统(Bio—Ra公司)；冷冻离心机(日立公司CFl6R)【)；酸度计(梅特勒一托利多仪器有限公司)；电子天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；721分光光度计(Varian公司)；LL一3000型冷冻干燥机(ThermoElectronCorporation)。1．3方法1．3．

5、1胶原蛋白的提取从新鲜的羊肋软骨中切取透明软骨，剥去骨膜，去除骨化部分，用生理盐水洗净，切成0．收稿日期：2009一∞一14基金项目：宁夏回族自治区教育厅资助项目(200749)；宁夏回族自治区科技攻关资助项目(2009年)作者简介：肖旭(1982一)，男，河北人，在读硕士研究生，从事生化药理学研究工作。通信作者：高岭(1958一)。女，研究员，硕士生导师，从事生化药理学研究工作。E—mail：一@nxmu．edu．crl5mm左右的薄片，液氮冷冻粉碎后称重，按照软骨量加入5倍体积的脱脂液(氯仿：甲醇

6、：水=l：2：0．8)在4℃下搅拌脱脂48h，期间每8h更换脱脂液直到脱脂完全，在同样温度和搅拌条件下用lO倍体积的0．ImoVL盐酸进行脱钙处理48h，直到软骨变柔软，离心去除脱钙液，按照每克软骨加入10倍体积的4mol／L盐酸胍，于4℃搅拌48h，120009离心20min，沉淀用Tris—HCl(pH7．4)缓冲液和0．5moL／L乙酸充分洗涤后，用5倍体积的胃蛋白酶消化液(0．5moL／L乙酸配成19／L)混悬，4℃下搅拌24h，120009离心30rain，收集上清液；沉淀再加5倍体积的胃蛋

7、白酶消化液重复酶解一次，离心收集上清液。混合两次上清液，用5mol／LNaOH迅速调节上清液至pH7．4。加入氯化钠(NaCI)使其浓度为3mol／L，40C盐析过夜，离心得到上清液和沉淀Al。调NaCI浓度至4moVL时．40C盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A2。取沉淀Al用0．1moL／L乙酸溶解。2moL／LNaOH中和至pH7．4，分别再用0．05moL／LTris—HCI(pH7．4)、蒸馏水进行透析平衡后，即得胶原初提液sl。1．3．2阴离子交换树脂(DEAE32)的预处理DEAE一32经

8、过溶胀、酸处理、碱处理后，用去离子水平衡至中性，处理好的离子交换载体置于4℃冰箱冷却备用。1．3．3蛋白批量离子交换将蛋白初提液s1和3倍体积的％s—HCI(pH7．4)缓冲液混合后，置于烧杯中，加入适量用缓冲溶液平衡后的阴离子交换载体，使树脂和蛋白溶液的体积比约为l：5，混合均匀，缓慢搅拌120rain后，120009离心，收集上清液。于上清液中加入氯化钠使其浓度为3moVL，4℃盐析过夜，120009离心30min，收集沉淀。将沉淀用0．1moVL乙