羊软骨ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

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1、羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定：肖旭，石文达，姚青，陈虎，王基云，李晓兵，高岭【摘要】目的从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白，并对其进行鉴定。方法选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后，用盐酸胍去除蛋白多糖，经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤，提取纯化蛋白，然后进行鉴定。结果4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意；氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的蛋白与Sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致。Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212nm。结论从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高，且符合II型

2、胶原蛋白的特征。【关键词】Ⅱ型胶原蛋白；软骨；蛋白多糖　　Abstract:ObjectiveToisolateandpurifycollagentypeⅡ(CⅡ)fromSheepcartilageandtoidentifyitspurity.MethodsTheSheepcartilagesaterials.Afterdegreasinganddecalcification,Guanidinehydrochlorideovetheproteoglycans.Thedigestionofpepsin,saltingofsodiumch

3、lorideedforextractingCⅡandidentification.ResultsTheproteoglycanscouldbeefficientlyremovedby4mol?L1guanidinehydrochloride.Theresultsitedenzymedigestionofpepsinadded.TheoptimizingconcentrationofsodiumchlorideforsaltingCⅡol?L1.ItaCⅡelocationbySDSPAGE.Theabsorptionpeak.Co

4、nclusionTheCⅡisolatedfromSheepcartilagehashighpurityandaccordsatoidArthritis，RA)有显著的疗效［4］。对于胶原蛋白的提取目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在很大的差别［5-8］。本研究选择宁夏富有的绵羯羊肋软骨为原料，来制备较高纯度的Ⅱ型胶原，报告如下。　　1实验材料和方法　　1.1主要试剂和耗材胃蛋白酶(Amresco公司)；盐酸胍（Amresco公司）；牛Ⅱ型胶原蛋白参照品(C7806Sigma公司)；46～200kD蛋白质分子量标志物(宝生物工

5、程有限公司)，阴离子交换载体(DEAE32上海试剂二厂)，透析袋（德国SercaFeinbiochemica公司），余试剂均为国产分析纯。　　1.2主要仪器电泳仪(Bio-Rad公司)；凝胶全自动图像分析系统(Bio-Ra公司)；冷冻离心机(日立公司CF16RX)；酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；721分光光度计(Varian公司)；LL-3000型冷冻干燥机（ThermoElectronCorporation）。　　1.3方法　　1.3.1胶原蛋白的提取　　从新鲜的羊肋软骨中切取透明软骨，

6、剥去骨膜，去除骨化部分，用生理盐水洗净，切成0.5mm左右的薄片，液氮冷冻粉碎后称重，按照软骨量加入5倍体积的脱脂液(氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8)在4℃下搅拌脱脂48h，期间每8h更换脱脂液直到脱脂完全，在同样温度和搅拌条件下用10倍体积的0.lmol/L盐酸进行脱钙处理48h，直到软骨变柔软，离心去除脱钙液，按照每克软骨加入10倍体积的4mol/L盐酸胍，于4℃搅拌48h，12000g离心20min，沉淀用Tris-HCl（pH7.4）缓冲液和0.5mol/L乙酸充分洗涤后，用5倍体积的胃蛋白酶消化液(0.5mol/L乙酸配成1g

7、/L)混悬，4℃下搅拌24h，12000g离心30min，收集上清液；沉淀再加5倍体积的胃蛋白酶消化液重复酶解一次，离心收集上清液。混合两次上清液，用5mol/LNaOH迅速调节上清液至pH7.4。加入氯化钠（NaCl）使其浓度为3mol/L，4℃盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A1。调NaCl浓度至4mol/L时，4℃盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A2。取沉淀A1用0.1mol/L乙酸溶解，2mol/LNaOH中和至pH7.4，分别再用0.05mol/LTris-HCl(pH7.4)、蒸馏水进行透析平衡后，即得胶原初提液S1。　　1.3

8、.2阴离子交换树脂(DEAE32)的预处理　　DEAE-32经过溶胀、酸处理、碱处理后，用去离子水平衡至中性，处理好的离子交换载体置于4℃冰箱冷却备用。　　1.3.3蛋白批量离子交换　　将蛋白初提液S1和3