[精品]小孢子培养技术.doc

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1、4.2小孑包子培养技术421小抱子培养步骤421」选蕾：一般选择在天气晡朗的正午8：00-10：00之间取材，尽量选取主花序或生长状态较好的花序，然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾备用。注释：%1、如呆遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小砲子的胚胎发生。%1、林蓝型油菜花序一般选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾，但是不同的汕菜品种花蕾的发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小电子进行镜检以确定恰当发育时期（最佳时期为单核晚期至二核期）。%1、取蕾以后如果不能立刻进行小他子的提取过程的话

2、，应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。421.2消毒:选取的花蕾用75%的酒精消毒lmin（一般不要超过一分钟），然后用升汞消毒8・10min,最后用无菌水清洗3次，每次5mine421.3抽提花粉：%1、将花蕾放置于玻璃管中，加入1・2滴B5液体培养液，用玻璃棒研擁使花粉散出，倒入过滤器过滤，花粉滤液盛入10ml离心管%1、用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2-3次后，在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释%1、将花粉悬浮液离心，800转/min,离心5min%1、将离心管屮的上层淸液吸去，再加液体B5抽提液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心（

3、用封口膜封口）,800转/min,离心5min,吸去上层清液421.4加倍培养:%1、将沉淀的花粉用NLN-I6液体培养基稀释（注:稀释不要超过10ml,因为加倍完以后还要在10ml的离心管屮再次稀释离心），倒入三角瓶在32°C条件下暗培养2天左右（48h-72h之间）。%1、然后检査是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养。421.5胚诱导培养：%1、将加倍后没有污染的NLN-I6花粉悬浮液再次倒入离心管屮离心，600转/min,离心5min,倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉。%1、将沉淀的花粉再次用NLN-I3培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入7

4、.5cm培养川1.,一般毎川I•加入悬浮液3ml左右,每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封口。%1、将封口的培养肌在25'C的条件下进行暗培养，大概10天左右开始查看是否有可见的颗粒状胚的形成,如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，贝9移至50rpm>25°C恒温摇床上继续进行暗培养。%1、当暗培养的胚发育至子叶形胚形成时移入B5固体培养基，于20°C,16hi•光/8hi•暗，2000LUX光强条件下培养。4.2.2再生茁的诱导与培养阶段4.2.2.1将暗培养获得子叶形胚移入B5固体培养基,于20°C,16hr光/8hr暗,2000LUX光强条件下

5、培养,进行再生苗的诱导。4.2.2.2进行•再生苗诱导培养的胚一般15天左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基的中生长状态决定，继代1・2次直至长出再生植株。4.2.2.3长出的再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代4.2.3移栽阶段获得的再生苗一般在10月屮旬开始移栽到大111,移栽时先要洗尽根部的培养基，移栽后立刻浇足定根水，用遮阳网覆盖，一般白天覆盖，晚上打开，直至移栽的再生苗成活,然后按照一般的大出管理进行管理。附注I：组织培养所用基木培养基母液配方（0L）B5MSNLN大最元索（20X）KNO350382.5N

6、H4NO3■■33■■CaCl2.2H2O38.8MgSO4.7H2O57.42.5KH2PO43.42.5(NH4)2SO42.68■■■■NaH2PO4.2H2O3.392■■■■Ca(NO3)2.4H2O■-10铁盐（20X）FeSO4.7H2O0.5560.5560.556Na’.EDTA0.7460.7460.746微量元索（200X）KI0」50」660」66H3BO30.61.241.24MnSO4.H2O24.463.474ZnSO4.7H2O0.41.722.118Na2MoO4.2H2O0.050.050.05CuSO4.5H2O0.00

7、50.0050.005CoC12.6H2O0.0050.0050.005有机成分（200X）(IX)肌醇2020200.1烟酸0.20.11卄氨酸■■0.40.4盐酸硫氨（BJ20.020.1盐酸毗哆索（BQ0.20.10.1叶酸■■■■0」生物索■■■■0.01谷氨醜胺■■-1600.8丝氨酸一—200.1谷胱廿肽（GSH）——60.03注意事项：%1、配药品时注意事项A.称量要梢确B.倍数越高的越需要正确小心C.天平要水平，操作要轻D.吸潮的药品称戢要快，且耕确至0.00l-0.002g%1、在配置药品的过程屮严格按照配方顺序依次加入药品，且要保证前一药

8、品溶解后再加入后…药品%1、叶酸加少量氨水溶解附注2