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1、甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术论文.freelm的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽相同,可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期,最佳时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取,应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。2游离小孢子分离先用75%的医用酒精将花蕾表面灭菌30～60s,.freelin,再用无菌水冲漂洗3次,每次5min。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2mLB5提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45μm的尼龙网,或0.22μm孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10mL离心管
2、里,用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲2~3次后,在10mL离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rpm,离心5min;将离心管中的上层清液吸去,再加液体B5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1800rpm,离心5min,吸去上层清液。3小孢子加倍培养将沉淀的花粉用NLN-16液体培养基稀释,稀释不要超过10mL,因为加倍后还要在10mL的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2d左右(48~72h);然后检查是否有污染,如果没有污染,则分皿继续培养。4胚诱导培养将加倍后的NLN-16花粉悬浮液倒入离心管离心,80
3、0rpm,离心5min,倒掉NLN-16液体;将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿,一般每皿加入悬浮液3mL左右,含花蕾1.5~2.0个/mL,小孢子密度为10~50万个/mL,用封口膜封口;将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养,10d左右开始查看是否有可见的颗粒状胚,如果没有则继续培养2。5胚状体培养当肉眼可见的小胚状体出现时,把培养皿放在摇床上振荡暗培养5~7d,转速为80～100rpm。然后将鱼雷形、子叶形胚状体移植到B5固体培养基上,在25℃光暗交替条件下持续培养,诱导植株再生3。6再生苗培养培养1~2周后,见到子叶长大变绿,胚根
4、伸长,长满白色根毛。继续培养后形成真叶,胚根不再伸长。当达到3～4片真叶时,再转移到生根培养基上生根,或在附加1mg/L6-BA的B5培养基上进行扦插繁殖,获得完整植株。7再生植株倍性鉴定对再生植株进行细胞学鉴定(染色体数目)或在开花以后根据花器形态(雄蕊和花瓣形态)进行鉴定4-7。若是单倍体植株,需要再加倍培养成双倍体,可以把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的顶芽、腋芽上;或者初花期把单倍体植株从土壤中取出,洗净根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙碱溶液泡1.5～8.0h,再移栽田间;或者胚状体再生获得的试管苗,在含10～100mg/L秋水仙碱的B5液体培养基中无菌培养4～8d
5、,转到无秋水仙碱的B5培养基中培养7～14d,然后移栽到土壤中8,9。8
