第三章 核酸扩增技术课件.ppt

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1、第三章核酸扩增技术PolymeraseChainReactiontechniques大纲要求：掌握PCR的原理和反应过程掌握PCR反应体系掌握PCR产物的检测熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法了解以PCR为基础的相关技术Special二、教学内容第一节聚合酶链式反应第二节以PCR为基础的相关技术第三节PCR产物的检测第X节实时荧光定量PCR现在位置P169基础知识遗传中心法则现在位置P169+基础知识基础知识DNA加热变性DNA冷却复性一、核酸分子杂交的基本原理基础知识DNA变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA分

2、子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。基础知识基础知识融解温度（Tm）定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。基础知识meltingtemperature，DNA复性定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。基础知识基础知识基础知识dNTPdATPdCTPdGTPdTTPdNTPPCR概念：在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程。第一节聚合酶链式

3、反应现在位置P169一、PCR的原理和反应过程PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得以扩增，每一次复制包括3个步骤：变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）现在位置P125变性（denaturation）将待复制的双链DNA经加热至94℃～95℃）左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，使之成为单链分子，作为反应的模板（template)，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；现在位置P170退火（annealing）温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融点温度以下（40

4、～70℃），使引物能与模板互补结合，形成杂交链；现在位置P125延伸（extension）将温度升至72℃左右，使反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3’端，使杂交双链不断延伸，以至形成新的DNA双链。现在位置P125PCR的基本反应过程变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C现在位置P170（40-70˚C）PCR的扩增效率现在位置P170循环次数：0123…n产物数量：2222…20123n每一次循环后，一分子模板被扩增为两个分子每个循环所产生的DNA片段，即为下一个循环的模板PCR产物量以指数形式

5、增长模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+二、PCR体系基本组成成分现在位置P170模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPs缓冲液二、PCR体系基本组成成分现在位置P170模板(template)模板就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。在用RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。现在位置P125耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）是从一种生活在热泉（80～90℃）中的水栖噬热菌（Thermu

6、saquaticus）中提取的，有很高的耐热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物的3’-OH端,加上dNTP,在二者间生成3’，5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸。现在位置P170dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中4种核苷酸的浓度必须一致四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增降低在dNTP浓度会提高反应的特异性一般为20~200umol/L现在位置P170镁离

7、子浓度镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素，因为镁离子对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影响。Mg2+浓度过低使酶活力降低Mg2+浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。一般为1.5mmol/L现在位置P172引物(Primer)引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。现在位置P170引物设计时必须遵循的原则（6条）用于PCR反应的引物需要二条，分别设在被扩增目标片段的二端，并分别与模板正负链序列互补。引物的长度一般以18～25个核苷酸为宜

8、引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹状结构，引物过短则会降低扩增的特异性；现在位置P171引物设计时必须遵循的原则二条引物之间（尤其在3’端）的序列不可有互