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1、核酸扩增技术温州医学院检验医学院、生命科学学院SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege主要内容第一节聚合酶链反应技术第二节荧光定量PCR技术第三节其他核酸扩增技术第四节临床基因扩增实验室的管理与质量控制SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege第一节聚合酶链反应技术polymerasechainreaction,PCR一、PCR技术发展简史二、PCR技术原理三、PCR反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析五、PCR常见问题与原因分析六、PCR
2、衍生技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollegePCR技术发展简史Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使用的DNA聚合酶是Klenow片段。(1993年诺贝尔化学奖获得者)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollegePCR技术发展简史1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR。1988年Saiki发现TaqDNA聚合酶，从此PCR技术得以广泛应用。Schoo
3、lofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege基本原理N=N0(1+E)cSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollegePCR反应体系、条件及其优化PCR反应体系模板（template）引物（primers）DNA聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCR缓冲液（PCRbuffer）PCR反应条件变性退火延伸循环SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollegeDNARNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、
4、病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板（template）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege引物（primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimerSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege引物的重要性在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶D
5、NA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege引物设计总原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege引物设计一般原则引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物的内部稳定性引物
6、的保守性与特异性扩增区域的二级结构SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege引物长度一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24bp。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区
7、分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege碱基分布的均衡性GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。同一碱基连续出现不应超过5个SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege引物Tm值一般要求：55℃-65℃。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根
8、据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则
