《核酸体外扩增》PPT课件

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1、第十一章核酸体外扩增本章讨论3个问题：什么是核酸体外扩增；为什么能进行核酸体外扩增；怎样进行核酸体外扩增。为了便于大家理解，我们先介绍几个相关问题。1、体内DNA复制体外酶促基因（DNA）扩增（1）模板ds→ssds→（热变性）ss（2）酶DDDP（II）耐热的Taq酶有3’→5’外切酶活性有5’→3’外切酶活性5’→3’外切酶活性无3’→5’外切酶活性（3）引物RNADNA（4）dNTP√√（5）Mg2+√√（6）反应缓冲体系√√（7）反应温度37℃94℃，55℃，70-72℃核酸体内扩增和核酸体外扩增2、PCR引物相关概念ABab5‘3’5‘3’引物a与A链一致，在5’端，与B链互

2、补，所以a为上游引物3‘端引物反义引物左侧引物向前合成引物反之b为下游引物5‘端引物正义引物右侧引物向后合成引物3、为什么要进行PCR？为了获得基因诊断的材料。进行基因定量（表达异常）和进行基因定性（结构异常）以及获取研究的材料。PCR--------所谓PCR，又称体外酶促基因扩增，是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特征，模仿体内DNA的复制过程，在附加的一对引物之间诱导的聚合酶反应。基本原理：在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。第一节聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)一

3、、PCR的基本原理PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时两引物3’端相对，5’端相背。在合适条件下，由Taq（或其他）DNA聚合酶催化引物引导的DNA合成，即引物的延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性→复性→延伸的过程就是一个PCR循环（图11-1）。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。延伸产物经第二循环变性后，亦与引物互补，作为引物引导DNA合成的新模板。因此，第二循环后

4、，延伸的模板由第一循环的4条增加为8条（包括原始模板在内），依此类推，以后每一循环后的模板均比前一模板增加一倍。理论上，扩增DNA的产量是指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。图11-1明显指明了扩增片段的末端是由两引物5’端限定的。1、（高温）变性（94℃）（denaturation）----在摩尔数大大过量的两段寡核苷酸及4种dNTP参入下，对模板DNA进行加热变性，通过加热使DNA双螺旋氢键断裂，双链解离形成单链DNA。（denaturation）。2、（低温）退火（55℃）（annealling）----将反应混合液冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。当温

5、度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物与其互补模板在局部形成杂交链，而模板双链之间互补的机会较少。3、（中温）延伸（70-72℃）（extension）----在底物4种dNTP及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链按5’-3’方向进行延伸反应。以上3步为一个循环。在PCR仪（或手动PCR）作用下，如此反复进行变性、退火和延伸循环，从而使产物迅速得到扩增。几十轮反应仅需数小时，介于两个引物之间的特异性DNA片段可得到大量复制，数量可过2×106-2×107拷贝。有人将这一过程描述成：高温变性，低温退

6、火，中温延伸，cycle，cycle。PCR是3个反应的有序组合和循环：基本步骤：变性：加热使双链DNA变为单链退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应PCR的基本原理示意图二、PCR引物设计原则在PCR反应中使用的耐热Taq（或其他）DNA聚合酶，相应的缓冲体系及dNTP（核苷三磷酸）已经商品化，可从相应公司购买现成待用的，但有两个关键成份是有待研究人员准备的：第一个是核酸模板（我们放在引物设计原则之后讨论），不能有污染，不能有聚合酶抑制剂。第二个是寡核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成败的关键。PCR引物设计的目

7、的是找到一对合适的核苷酸片段，使其有效扩增模板DNA序列，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保成功，但遵循下述原则，则有助于引物的设计。1、待扩增片段必须是已知的（至少2个引物互补序列是已知的），在片断两侧确定引物序列。2、引物长度一般为15-30个核苷酸，可以据需要设计的更长一些，但至多到50个核苷酸左右。（注：引物的有效长度Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，否则，最适延伸