第九章 核酸的体外扩增

《第九章 核酸的体外扩增》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第十一章核酸的体外扩增聚合酶链式反应连接酶链反应RNA的体外扩增1第一节聚合酶链式反应polymerasechainreactionPCR2PCR的发明：发明人：KaryMullis。1983年，Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法，即PCR。1985年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中引起了巨大的反响。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。随后Cetus给了M

2、ullis一万美元的奖金，然后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物技术公司。1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。3Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项突破。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值，并对分子

3、生物学技术的发展给予巨大的推动。4一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与待扩增DNA发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。5flash6㈠DNA模板变性双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。㈡模板与引物退火45～55℃，两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。㈢引物延伸72℃左右在4种dNTP底物及Mg2

4、+存在条件下，DNA聚合酶将单核苷酸从引物3′端掺入，沿模板延伸合成新股DNA，每一循环的产物可作为下一循环的模板。7以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般需进行25-30轮的循环。8PCRflash9二、PCR引物的设计引物引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸，两段引物分别与相应的一条DNA链3’端及5’端互补。10引物的设计一般遵循下列原则：１.上游引物与目的DNA５’端序列完全相同；下游引物与目的DNA３’端序列互补２.引物长度以15-30个碱基为益；G+C含量为45-55％３.

5、引物内、引物间不应有互补序列４.碱基分布随机５.引物与非特异扩增区的同源性不超过70%6.3′端必须互补，5′端可游离11三、模板的制备DNA1.从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化RNA新鲜组织或细胞所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理12四、PCR的基本反应（一）、以DNA为模板的反应：10×缓冲液　10l4种dNTP混合物　各200mol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA　　　　0.1～2gTaqDNA聚合酶　2.5u　Mg2+1.

6、5mmol/L加双蒸水至　100l13PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶来自水生栖热菌Thermusaquaticus良好的耐热性Mg2+依赖性无校正功能14（二）以mRNA为模板的反应mRNA5l5×Buffer4ldNTP2l(10mmol/L)RNasin1l(20u)逆转录酶1l(10u)Oligo(dT)12-18(或下游引物)1lddH2O6l/20l42℃水浴1小时，95℃水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：1510×Buffer5l25mmol/L

7、Mg2+3lTaq酶0.5l（2.5u）上游引物1lddH2O20.5l/50l按PCR循环参数进行RT--PCR16（三）PCR产物的积累规律DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物—模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和—平台期。（30个循环）“平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。17（四）PCR反应的自动化18五、PCR反应条件的控制（一）PCR反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度

8、和某些离子10～50mmol/LTris-HCl缓冲液50mmol/LKClBSA或明胶（二）镁离子浓度TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。一般常用1.5mmo