核酸体外扩增技术综述

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1、核酸体外扩增技术研究进展摘要体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。关键词核酸体外扩增聚合酶链式反应（PCR）等温扩增核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（

2、DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不断涌现[1]。一、聚合酶链式反应(PCR)PCR（PolymeraseChainRe

3、action）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面[2]。聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的

4、核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。一、核酸等温扩增技术等温扩增技术(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸体

5、外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中[3]。1、

6、链替代扩增技术链替代扩增，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在切口处向3’延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下进行扩增。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。SDA的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成。2、滚

7、环扩增技术滚环核酸扩增（rollingcircleamolification，RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短

8、的时间内，产物呈指数递增。3、依赖解旋酶DNA扩增依赖解旋酶DNA等温扩增技术是美国NEB公司于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，