核酸扩增仪课件

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1、第十三章PCR核酸扩增仪(PCRnucleicacidAmplifier)教学基本要求掌握核酸扩增仪的工作原理和主要性能指标。掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。熟悉PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。了解PCR扩增仪的操作规程；PCR扩增仪常见故障的排除；PCR扩增仪的应用。内容提要第一节PCR核酸扩增仪的工作原理第二节PCR核酸扩增仪的分类与结构第三节PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除第四节PCR核酸扩增仪的临床应用第一节PCR核酸扩增仪的工作原理PCR

2、技术的发展简史PCR技术的原理核酸扩增仪的工作原理PCR技术的发展简史1971年，KjellKleppe等描述的一项基于酶的体外DNA复制实验。1985年美国PE公司KaryMullis在开车前去北加利福尼亚红树县的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR。1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖。PCR技术的原理PCR技术的本质是核酸体外扩增加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数

3、。PCR技术的原理PCR循环–第一步–加热变性PCR技术的原理PCR循环-第二步–引物与模板DNA分子退火Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’PCR技术的原理PCR循环-第三步-引物延伸Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR技术的原理第1个PCR循环完成后——得到两个拷贝的靶序列PCR技术的原理30次循环后靶序列扩增的数量循环数扩增产物量（2n）121＝2222＝4323＝8424＝16525＝32626＝6420220＝1,048,57630230＝1,073,741,824PCR核酸

4、扩增仪的工作原理PCR核酸扩增仪的工作关键是：温度控制PCR核酸扩增仪的工作原理控温方式水浴锅控温压缩机控温半导体控温离心式空气加热控温第二节PCR核酸扩增仪的分类与结构普通定性PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪普通定性PCR核酸扩增仪按照变温方式分为以下三类：水浴式PCR仪变温金属块式PCR仪变温气流式PCR仪普通定性PCR核酸扩增仪——水浴式PCR仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。特点：仪器体积较大，但变温快、时间准

5、、温度均一，目前国内应用较少。普通定性PCR核酸扩增仪——变温金属块式PCR仪中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。凹孔内壁加工精密，保证与样品管紧密接触。一般通过半导体加热和冷却，并由微机控制恒温和冷热处理过程，通过键盘和显示器实现人机交流，并可编程、存储或删除程序。特点：仪器装置比较牢固耐用，温度变换平稳，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。普通定性PCR核酸扩增仪——变温气流式PCR仪由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻元件和吹风机组成，形成热空气枪借空气作为热传播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部

6、冷空气制冷，精确的温度传感器构成不同的温度循环。特点：仪器不用金属精密加工，成本较低；整个系统没有液体流动及制冷剂，安全程度高。配上微机和软件，可灵活编程。普通定性PCR核酸扩增仪按照功能用途可分为以下两类：梯度PCR仪原位PCR仪普通定性PCR核酸扩增仪——梯度PCR仪由普通PCR仪衍生出的具温度梯度功能的核酸扩增仪。多种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完成既节省实验时间、提高实验效率，又节约实验成本。梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据扩增结果，一步就可以摸索出最适退火条件。普通定性PCR核酸扩增仪——原位PCR仪是原位杂交与PCR技术的

7、结合。在细胞内进行PCR扩增，而不破坏组织细胞的形态。解决了以往手工方法操作复杂，扩增效果及实验结果重复性不理想的问题。与普通PCR仪的区别：其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR，RQ-PCR)技术是在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号达到定量的目的。实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PC