分子生物学实验指导.doc

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1、分子生物学实验指导动植物检疫专业2012，210分子生物学实验注意事项 1． 课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。2． 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。3． 实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。4． 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！5． 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作

2、的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。6． 写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。7． 在实验室内不能大声喧哗。8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。 10实验一质粒DNA的提取1．目的学会最常用的小量制备质粒DN

3、A的碱裂解方法。2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架

4、，标签纸，磁力搅拌机。4．试剂pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。5．实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200mL5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，

5、121°C20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20°C保存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5

6、ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C30min）。6．操作步骤（1） 在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。（2）从超低温冰箱中取出保存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇20h。10（3）  取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。（4）  在沉淀中加入10

7、0ml溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5） 加入200ml溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加入150ml溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7） 15000rpm离心5min，小心吸取400ml上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800ml95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）  15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500ml7

8、0%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9