纸层析法鉴定转氨基作用.ppt

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1、纸层析法鉴定转氨基作用一、目的１.掌握氨基酸转氨基作用和纸层析的原理２.熟悉纸层析的操作技术二、原理１.氨基酸的转氨基作用谷氨酸+丙酮酸α-酮戊二酸+丙氨酸谷丙转氨酶２.层析理论层析法：是利用混合物各组分物理、化学性（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同的区域，借以将各组分分离。固定相——水流动相——苯酚由于混合物中的有效成分和杂质受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度不同，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到分离。三、步骤1.肝匀浆的制备

2、取兔肝剪碎，在研钵中先加磷酸盐缓冲液１ml，待研匀后再加２ml缓冲液。２.取干净试管2支，分别标明测定管与对照管，按下表操作。试剂（d）测定管　对照管肝匀浆101037℃水浴10min沸水浴10min丙氨酸1010α-酮戊二酸101037℃水浴20min2.点样取直径13cm圆形滤纸1张，用圆规在滤纸正中作一半径为1cm的小圆圈作为层析底线，用铅笔通过圆心作两点互相垂直的线，并在两线外端等距离点4个原点，标明1、2、3、4。分别用毛细吸管吸取测定管上清液、对照管上清液、0.1M谷氨酸溶液、0.1M丙氨酸溶液各3滴，依次点在滤纸上标明1、2、3

3、、4的原点处。注意点样斑点不可太大。直径应小于0.5cm，每点一滴，用吹风机吹干后方可再点第二滴，并且点样量应力求均匀相等。[步骤]3.层析在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小），另取同类滤纸小片1X2cm，下一半剪成须状。将此小片卷成圆筒如灯芯插入小孔（不要突出于滤纸面）将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液中,可见溶剂沿灯芯上升到滤纸，再沿滤纸以同心圆式向四周扩展，待溶剂前沿距滤纸边缘约1cm处（约45-60分钟），取出滤纸。去处灯芯立即用铅笔划出溶剂前沿，用吹风机吹干。[步骤]3.显色将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器向滤纸均匀喷射0.1%

4、茚三酮溶液，再用吹风机吹干，此时可见紫红色的同心弧形斑点出现，用铅笔圈下各显色点。比较色斑的位置及色泽深浅，分别计算丙氨酸和谷氨酸的Rf值及样品中氨基酸的Rf值，分析实验结果。[步骤]4.用铅笔描出色斑轮廓,并按下表记录有关数据,计算Rf值。“谷”“丙”“对”“测”点样处至色斑中心距离(cm)点样处至溶剂前沿距离(cm)Rf值将“对”、“测”各色斑的Rf值与已知氨基酸的Rf值进行对比，确定它们各是什么氨基酸。据此解释转氨基作用。