氨基酸的分离鉴定——纸层析法.ppt

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1、生物化学实验教案生化小老师一组生物化学实验室生化小老师团队氨基酸的分离鉴定——纸层析法3，5—二硝基水杨酸比色法测还原糖和总糖含量氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验目的实验原理实验试剂与仪器实验步骤注意事项实验结果与分析实验目的1掌握氨基酸纸层析法的原理2熟悉纸层析法的实验操作3分离鉴别未知氨基酸样品的成分。实验原理纸层析纸层析法属于分配层析，层析滤纸为载体，流动相是指层析液，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具亲水性使这部分水束缚在纤维

2、素周围，不易扩散而成为固定相。实验原理在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析液向上移动得快，形成的斑点集中在滤纸的上部；而分配系数小的氨基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。实验原理分配系数指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。分配系数反映了溶质在两

3、相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和pH值均会影响比移值Rf。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析液向上移动得快，形成的斑点集中在滤纸的上部

4、；而分配系数小的氨基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离实验原理茚三酮的显色原理氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann'spurple）。实验试剂与仪器试剂纯净的赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸8×10E-3mol/L溶液；四种氨基酸混合溶液（每种浓度与对应纯净溶液一致）；2.

5、5%茚三酮丙酮溶液；酸性展层剂（正丁醇：88%甲酸：水=60：17：8）。仪器钟罩×1、培养皿×1、小烧杯10ml×1、层析柱×1、小漏斗×1、新华一号滤纸（14cm×17cm）×1、电吹风、烘箱、毛细管、订书机，及其他常用仪器。实验步骤点样平衡层析显色点样取洁净滤纸一张，在距底边2cm线上取五个点（每两点相隔距离2cm），分别用毛细管将各氨基酸样品点在五个点上，点样大小以直径3mm左右为宜，不要超过5mm，冷风吹干，重复点样一次，吹干。实验步骤实验步骤平衡将滤纸卷成柱状将两边缘对齐（注意不要让两端接

6、触，造成层析液上升高度不一致），并用订书机订好，将滤纸竖直放置在洁净的培养皿中（不要接触培养皿壁），旁边摆放一个内盛展开剂的小烧杯，盖上钟罩平衡30min。实验步骤层析平衡结束后，打开钟罩上端塞子，通过已润洗的“漏斗—层析柱”装置向培养皿内加入展层剂30～40ml至液面达到培养皿2/3处为宜（层析柱不能碰到滤纸），小心抽出装置（不要让层析液滴落在滤纸上），盖上塞子开始层析，直到前沿达到距滤纸上端1cm刻线处（此过程2～3小时）。实验步骤显色取出层析好的滤纸（需带手套），拆开订书钉，用电吹风冷风吹干。将

7、滤纸放入烘箱烘烤5min左右，待显色后取出。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，找到中心点，测出中心点与原点水平线的距离，计算各种氨基酸的比移值Rf，判断混合点上端各点是什么氨基酸。注意事项1.整个操作过程需带手套进行，不要对着滤纸说话，以免滤纸被污染。2.点样时应注意毛细管的取放，以免污染试剂。3.点样吹干时不宜吹得过干。4.柱状滤纸边缘尽量保持竖直，边缘的坡度会影响层展的速率及效果。订的钉子上下各两颗为宜。实验结果及分析——图像实例——各氨基酸比移值Rf实验结果及分析氨基酸赖氨酸天冬氨酸丙氨酸亮（白）氨

8、酸Rf0.22940.38140.57710.8609在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和pH值均会影响比移值Rf。实验中，Rf值与个人操作及具体实验条件息息相关，存在一定波动，但总体趋势相同。——思考问题实验结果及分析层析过程中，滤纸上前沿会出现些许黄色物质，你认为这是什么？为生整个实验过程需要戴手套进行？简述你认为怎样点样可以得到较小斑点。为什么要平