氨基酸的分离鉴定(纸层析法)

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1、氨基酸的分离（纸层析法）一、实验原理1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。

2、当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。分配系数=溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度物质被分离后在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性依据。氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。二、实验器材标准氨基酸溶液、滤纸

3、、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。三、实验试剂1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：22、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5四、实验操作1、点样量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上

4、，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。2、层析与显色将滤纸卷成圆筒形，用钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。将滤纸垂直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖（点样点的一端朝下，展层剂液面需低于点样线1cm左右）。待溶液前沿线距滤纸末端1~2cm（展层长度10cm，约2h）后，取出滤纸（需带上手套），用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干（通风橱中进行），即可看见层析斑点。3、结果处理用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到层析前沿的距离，计

5、算各种标准氨基酸的Rf值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。五、结果与讨论1、层析图谱2、数据处理GlyPheProHis样品Y09中心到原点距离/cm0.43.751.651.600.4501.203.71前沿/cm10.39.759.559.509.85Rf/cm0.03880.3850.1730.1680.04570.1220.377参考Rf值0.300.730.480.11——————3、将样品的层析图谱与标准氨基酸层析图谱对比得出，样品中含有的氨基酸是：苯丙氨酸、脯氨酸和组氨酸。样品层

6、析图谱中最下方的斑点难以判断是组氨酸还是甘氨酸，结合Rf值和斑点的形状与颜色，初步判断是组氨酸。4、本次层析的结果不好，各标准氨基酸的Rf值与参考值相差较大（偏小），且样品的层析方向不垂直，斑点的朝向也不一致。如果仅仅是层析时纸筒没有放平，也不可能出现斑点朝向不一致的现象。将有层析结果的滤纸放置两天后，变成了以下情形：图中显示，层析溶剂出现了明显的分层（水相和有机相），可能是因为层析缸内壁有较多水，破坏了溶剂的比例。由于正丁醇与水的互溶有一定限度，过多的水与有机相无法互溶。到层析后期，有机相大部分到滤纸上时，

7、水相开始接触滤纸并向上移动。由于水相的存在切断了有机相与下方溶液的通路，有机相无法再向上移动，而水相不断在扩大其“势力范围”。因为有机相无法继续上移，有机相中溶解的氨基酸也无法随溶液移动，因此Rf值也测不准确。由图可以看出，层析斑点的形状与水相和有机相的分界线轮廓匹配，从而解释了为何斑点的朝向不一致。因为到层析后期，层析速度慢的氨基酸只能停留在水相与有机相的交界处。5、实验总结与改进：1）在做纸层析时，应严格保证展层剂各组分的比例，因为Rf值与展层剂的组成密切相关，且比例不对时还可能引起展层剂分层，严重影响实

8、验结果。2）将纸筒放入层析缸时一定要小心放平，否则层析方向会偏，后续测量层析点到原点的距离时容易产生误差。3）实验时一定要避免用手直接接触滤纸，也不要将滤纸随意放置，否则容易沾上蛋白质或氨基酸，给实验带来干扰。参考文献：1.杨丽，尤丽，叶金秀，袁燕，《纸层析分离鉴定氨基酸实验的改进》，云南民族大学学报，2011年5月，第20卷第3期。