纸层析法分离鉴定氨基酸

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1、实验二、纸层析法分离鉴定氨基酸一、目的：学习并掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的原理和方法。二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用比移值（Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y

2、）的比值。如图在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf值是常数，因此可作为定性依据。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、操作1.在层析缸中装入展层剂，其高度约1.5～2cm。2.准备滤纸:戴上手套，取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号，为点样位置（即原点），如图。注意事项：手不能直接接触滤纸；直线与底边平行。3.点样：用毛细管依次将Lys(赖)、Gly(甘)、Pro(脯)、Val(缬)、

3、Leu(亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。注意每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm。纸层析点样标准图LysGlyProValLeu混合样品4、展层：将点好样的滤纸(点样面朝外)卷成筒状，用透明胶纸粘接或用线缝好，纸的两边不能接触。将滤纸直立于层析缸中（注意：点样的一端在下，展层剂的液面需低于点样线1cm，滤纸勿与缸壁接触），盖好层析缸盖，进行展层。待溶剂上升15～20cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1％水合茚三酮正丁醇溶液，然后用电吹风吹干即可显出各层析斑点。卷成筒状的滤纸氨基酸显色后

4、的图谱溶剂前沿XY四、计算：用直尺测量并计算出各种氨基酸的Rf值。样品aa标准aaRf混合aaRf赖氨酸甘氨酸脯氨酸缬氨酸亮氨酸试剂和器材：1.试剂：(1)氨基酸溶液：0.5%(m/V)的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组分的浓度均为0.5％)。(2)展层剂：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶3(V/V)。(3)显色剂：0.1％(m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。2.器材：层析缸；层析滤纸（新华一号）；毛细管;喷雾器；电吹风；直尺；铅笔；针线或透明胶带；一次性手套。