1、氨基酸的分离鉴定--纸层析法

《1、氨基酸的分离鉴定--纸层析法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实验一：氨基酸的分离鉴定••纸层析法一、目的:通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理:层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异,使各组分以不同的程度分布在两个相屮，其屮一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。层析法是近代生物化学最常用的分析方法乞一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核昔酸、糖、蛋白质等。层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。纸

2、层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的径基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相,展层用的有机溶剂为流动相。水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的疑基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似

3、不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细隹用流到纸的另一端。在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂屮振荡时，它将在这两相屮不均匀分配。达到平衡时，这种

4、物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用a表示）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（（X）。分配系数不同:物质在溶剂I中的浓度a=物质在溶剂II中的浓度某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。Rf值的人小与物质的结构、性质、溶剂系统、纸层析纸的质量（新华一号）和层析温度等因素有关。物质被分离后在纸层析图谱上的位置Rf值（比移）来表示:原点到层析点中心的距离Rf=原点到溶剂前沿的距离印三酮颜色反应：印三酮在弱酸溶液中与a-氨

5、基酸基逑，引起氨基酸氧化脱氧、脱竣反应，最后印三酮与反应产物一氨和还原印三酮（hydrindantin）发生作用，生成紫色物质（NII3与印三酮反应形成紫色化合物）。用纸层析法或柱层析把各种氨基酸分开后，利用印三酮显色可以定性鉴定应用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸。两个业氨基酸，脯氨基酸和疑脯氨基酸与印三酮反应不释放NH3,而直接产生亮黄色化合物,最大光吸收在440nnio三、器材；1、层析缸（两人一组，四组共用一个层析缸）；2、培养皿（两人一组）；3、毛细管（药品是两组共用一套）；4、喷雾器；5、层析滤纸（新华一号）四、试剂1、扩展剂：4份水饱

6、和的正丁醇和1份醋酸的混合物（p.123）；（水饱和的正丁醇和乙酸的混合物。其屮被滤纸吸附的水为固定相，正丁醇为流动相，乙酸为层析提供酸性环境。）2、氨基酸溶液:0.5%的赖氨酸、脯氨酸、绷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分均为0.5%）；3、显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液五、軽：1、平衡：将盛有平衡溶剂的培养皿放入密闭的层析缸中，倒1厘米厚的扩展剂；2、滤纸（新华一号或者Whatman-1号）：在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一-条直线，在直线上每隔2cm作一记号（如书p.123）,共6个记号，这个记号是样品Rf值计算的原点;3、

7、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，点样量以30~40uL为宜,每点一次样，用吹风机吹干，然后再点一次；重复点样3〜4次。注意:点样时毛细管垂直轻轻接触滤纸,一触即止，每个点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。4、扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线lcirn待溶剂上升15cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或吹风机吹干。5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1%印三酮正丁醇溶液（与水不混溶且挥发性较大

8、的溶剂），用热风吹干（或烘箱100°C烘烤5分钟）显出个层析斑点（