实验1氨基酸的分离鉴定--纸层析法

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1、※实验一氨基酸的分离鉴定一纸层析法【实验目的】1、学习分配层析的原理；2、掌握氨基酸纸上层析的操作技术。【实验原理】层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。层析法是近代生物化学最常用的分析方法2—，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核昔酸、糖、蛋白质等。层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换

2、层析等。纸层析属于分配层析法。分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。进行分离时市于被分离物质的组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶丁•流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，于是得到分离。分配层析法屮不同溶质的分离取决于其在两相（固定相和流动相）间分配系数的不同，分配系数（Q）的定义是：a二溶质在固定相的浓度（CS）/溶质在流动相的浓度（CL）分配系数愈大，说明溶质在固定相屮的浓度就大，移动的就慢，反Z,溶质移动的就快。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的

3、疑基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。层析吋，将样品在距离滤纸2〜3cm的某一处（原点），在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。物质被分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上移动的速率用Rf表示。Rf=原点到层析点中心的距离（X）4-原点到溶剂前沿的距离（Y）（见图1）。纸层析中Rf=X/Y在一定条件下某种物质的Rf值是一个常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。【器材与试剂】

4、1、器材（见图2和图3）：层析缸（或直径20cm、高25cm的标本缸）1个/小组，点样毛细管6（个）/小组或25AL的移液枪，培养皿（直径18cm）1个/小组，50mL小烧杯或称量瓶1只/小组，10ml量筒1个/小组，20ml量筒1个/小组,喷雾器两个（公用），吹风机4个（公用），塑料薄膜（保鲜膜）（公用），层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）1张/小组，直尺、铅笔（自备），小托盘、针、白线1套/图2图3组（或用昆虫针代替），一次性手套1付/小组，皮套若干。2、试剂：（1）扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸的混合物。其中水为固定相，正丁醇为流动相，

5、乙酸为层析提供酸性环境。）具体配制方法：将20mL正丁醇和5mL乙酸（4：1）放入分液漏斗中，与15mL蒸馆水混合（即所得混合液再按体积比5：3与蒸饰水混合），充分振荡，静止后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯屮做平衡剂，其余的倒入培养皿屮备用。注：扩展剂可用75%乙醇代替（2）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、颔氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分的浓度均为0.5%）o（注：几年的实践发现纟颉氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸几种氨基酸层析的效果不好，几乎不能区分，因此将教材所用的苯丙氨酸去掉。）（3）显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液

6、。【操作方法】（检查玻璃器皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120C烘干。）1、制备扩展剂并平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，把盛有约20mL展层溶液的培养皿和盛有平衡溶剂的小烧杯（或称量瓶）置于塑料薄膜上，然后将层析缸或标本缸倒置于塑料薄膜上，平衡20mino2、准备滤纸图4带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做5个记号，记号之间间隔2cm,这就是原点（点样位置）的位置。另在距左边缘lcm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻

7、度（以厘米为单位），参见图4。3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在点样处，干后再点一次。点样量以30~40uL为宜，点样吋，用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径不超过3mmo4、扩展：用线将点好样品的滤纸缝成（或用细的昆虫针将滤纸的两边连接），纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。将制成筒状的滤纸直立于培养皿中（点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线lcm）（参见图5）,盖上层析缸，用塑料薄膜密封层析装置，开始层析。当扩展剂上升到A线吋开始计时，待溶剂上升15~

8、20cm时取出滤纸，剪断连线，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机吹干（注