应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用.ppt

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1、应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心制作人：王瑞刚实验原理实验试剂实验步骤实验原理氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应称为转氨基作用.转氨基作用是氨基酸的重要反应之一，由转氨酶催化.经转氨基后,原来的氨基酸变成了酮酸，原来的酮酸变成相应的氨基酸。纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧

2、光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。Rf=纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又

3、分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。实验试剂1．0.01MpH7.4磷酸缓冲液：0.2MNa2HPO4溶液81ml与0.2MNaH2PO4溶液19ml混匀，加蒸馏水稀释20倍。2．0.1ML-丙氨酸：称取0.891gL-丙氨酸（如DL丙氨酸用量加倍），用少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液溶解，以NaOH溶液小心调pH至7.4，再用磷酸缓冲液定容到100ml。3．0.1ML-谷氨酸：称取1.47g谷氨酸如上法配成100ml溶液。4．0.1ML-α

4、-酮戊二酸：称取1.46gα-酮戊二酸如上法配成100ml溶液。5．层析溶剂：用水饱和的苯酚。用新蒸馏的苯酚2份，加蒸馏水1份(V/V)，放入分液漏斗中剧烈摇动后，在暗处静置若干时间（7-10小时），待分层后，取下层清液备用。贮于棕色瓶中暗处保存。6．0.1%（W/V）茚三酮实验步骤1．肉糜制备：称取新鲜猪肝5克在低温下剪碎，用研钵研磨成糊状备用。2．酶促反应按表次序在2支试管中加入试剂。管号试剂对照管测定管0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/Lα-酮戊二酸(ml)0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液(ml)肉糜（g）1.01.0

5、1.01.01.01.01.01.0对照管当肉糜加入后立即煮沸l0min，而后放人37℃水浴中与测定管同时保温，测定管加入肌肉糜后放人37℃水浴中保温lh，然后于沸水浴中加热10min终止反应。冷却后将二管分别静置以备层析用。3．层析：取直径10-llcm圆形层析滤纸（已打孔）一张，通过圆心作一直径为2cm的圆，在圆周上分别取4等距点分别作测定管和对照管溶液及标准丙氨酸、谷氨酸的点样位置，点样时，将蘸水笔（使用前应放在酒精灯上烧红，冷却，对应溶液只能用对应的笔点样）轻轻靠到滤纸上(不能损伤滤纸)，使斑点直径为2-3mm(不能超过5mm)。为

6、了有足够量的样品点在滤纸上，每种样品应重复点3-4次，每次点样后待自然风干，再点下一次。另取一滤纸小条将其下端剪成刷状，卷成“灯芯”插人中心小孔处，使“灯芯”不突出纸面(少许突出纸面亦可)。然后将该层析圆滤纸平放在盛有水饱和酚的康维皿上，纸芯下端须状部分浸人溶液中，再在层析滤纸上罩一个大小合适的表面皿，溶剂沿纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，待溶剂前沿到达距康维皿边缘0.5-lcm处时(约lh左右)，取出层析滤纸，去掉纸芯，记下溶剂前沿，在电炉子上烘干以除去酚溶剂。将已烘干的滤纸平放于表面皿上，用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮溶液，放在电炉

7、子上烘干即可看到好几个紫红色斑点，比较各色斑点的位置及色泽深浅，并计算Rf值，分析实验结果。