用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用课件

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1、IdentificationofthetransaminationbypaperchromatographyExp.9用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用Purpose(目的)1.Tomastertheprincipleoftransamination掌握转氨基作用原理2.Identifythetransaminationbypaperchromatography用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用Principle（原理）1、transaminationR2CCOOHNH2H1RCCOOHOR2CCOOHOR1CCOOHNH2Haminoacidα-ketoacidaminoacidα

2、-ketoacidaminopherasetwoimportantaminopherasesGPT（acutehepatitis）GOT（myocardialinfarction）（两种重要的转氨酶）Reaction-thisexperimentCOOHCH2CH2COCOOH+CH3CH-NH2COOHGPTCOOHCH2CH2CH-NH2COOH+CH3COCOOH2、thepaperchromatography（纸层析）Ala,low-poleGlu,high-poleThestationaryphase:Fibrincombinewaterphenol,low-poleT

3、heflowingphase:（固定相）（流动相）XsYmTheforelandofsolventThecenterofthespeckleThecenterα↑Rf↓;α↓，Rf↑coefficientofdistributionα=Cs/CmCs：固定相中的浓度Cm：流动相中的浓度（分配系数：α）Rf=Xs/YmXs：溶质移动的距离Ym：溶剂移动的距离transportratio（迁移率）TheinfluencingfactoronRf：ThestructureandcharacteroftheAATheSolventsystemTemperatureThequalityof

4、thefilterpaper（影响因素）3、Color：(显色)OHOHOO2水合茚三酮+H2N-CH-COOHRONH4ONOO+RCHO+CO2罗曼氏紫Operation(操作)1、Theenzymaticreaction(酶促反应)12100℃，5minsadd0.5mlAla0.5mla–ketoglutarate1.5mlbufferMixup37℃,1hr1100℃10mincool23000rpm5minssupernatant肝匀浆（两种：已备好）（上清液）2、Chromatogram(层析)①Don’ttouchthefilterpaperbyhand②Mark

5、withpencil,holewithtoothpick③Spottingthesample(点样)④Chromatogram(层析)⑤Drying(烘干)⑥Color(显色)4(Glu)2(Ala)1(A)3(c)Results(结果）X1X1’X2X3X4Y1Y1’Y2Y3Y4Rf1Rf1’Rf2Rf3Rf4XYRf(1、assay;2、Ala;3、control;4、Glu)Rf=溶质层析点中心到原点中心的距离（X）溶剂前沿到原点中心的距离（Y）Discussions(讨论)1、2、questionsAttentions(注意)1.手洗净，滤纸勿污染，滤纸勿折，2.点样分配

6、标记用铅笔（1.2.3.4），3.点样点直径<0.4cm，1、3（点3次：干后重复）；2、4（点1次），点样的吸管勿串用，用毕放回原处。4.用牙签穿洞，做滤纸芯5.层析结束，铅笔先标出酚的前沿再烘干。（做记号）6.喷茚三酮时（不要对着人喷），前沿以内，喷均匀，。7.烘干后出现色班，铅笔圈下各色班。8.点样原点不是滤纸的圆心。9.层析剂是强腐蚀剂，勿触及皮肤、衣服。