脉冲场凝胶电泳的原理.ppt

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1、脉冲场凝胶电泳的原理及相关注意事项通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链DNA分子在电场作用下，在凝胶中的迁移率不同而达到分离的目的。当双链DNA分子超过一定的大小以后，DNA双螺旋的半径超过了凝胶的孔径，在琼脂糖中的电泳速度会达到极限，此时凝胶不能按照分子大小来筛分DNA。普通凝胶电泳脉冲场凝胶电泳(PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE)用于分离大分子量DNA片段的一种电泳方法。PFGE是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。影响PFGE的因素琼脂糖凝胶浓度浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动速度越快，适

2、合分离高分子量DNA1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段，不过条带很弥散缓冲液和温度温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致DNA带变形或解链。最佳电泳温度是14℃最常用的电泳液是0.5x的TBEbuffer，有时也可以用1.0x的TAEbuffer代替脉冲时间当电场方向发生改变,大分子的DNA便滞留在胶孔中,直至沿新的电场重新定向后,才能继续向前移动,大分子DNA重新定向需要的时间长当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DN

3、A就可以按其分子量大小分开分离不同大小DNA改变脉冲时间电压最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压和延长脉冲时间脉冲角度随着角度的减小，较大的片段分离的更好，较小的片段分离的效果降低。蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。注意事项凝胶在缓冲液中漂浮---蠕动泵的速度太快或太慢

4、，请调到合适的速度。缓冲液不流动或流速慢---检查冷却泵：当冷却泵制冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导致管道堵塞。电泳条带扭曲---因为流速太低，导致制冷不充分，或不均一、缓冲液体积必须大于2.2L可能遇到的问题以及解决方法条带变粗---减少上样量条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电场转换时间、上样量太高，调整样品浓度大片段DNA不能有效分离---降低电压、延长电场转换时间条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、上样时样品块被挤碎、泵速度太慢谢谢！！