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时间:2018-07-28
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1、PFGE(脉冲场凝胶电泳)标准操作规程(SOP)关键词:PFGE,脉冲场凝胶电泳目的:运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析:采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”(官微:PFGE_CHINA)进行图谱分析。系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理,提供二叉层级聚树,MLVA、MLST字符类型的最小生成树,SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制,用于分析菌株之间的相关性,协助追踪感染来源以及有效控制疫情。第一天一、 胶块的制备1、 在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照,分别加入约2ml细胞悬浊液(CSB
2、);2、 在1.5mleppendorf管上标记好对应样品的名称;3、 在模具上标记好对应样品的名称; 4、 用CSB湿润接种环,从培养皿上刮取适量细菌,均匀悬浊于CSB中,用bioMerieuxVitekcolorimeter测其OD值,并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5,加入CSB稀释;如果OD值小于3.6,增加菌量提高其浓度。5、 取400µl细菌悬浊液于相应的1.5mleppendorf管中,置于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、 从水浴箱中取出eppendorf管,每管加入20µl蛋白酶K(
3、储存液浓度为20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5mg/ml。7、 制备好1%SeakemGold:1%SDS,放于56℃水浴箱中。8、 在eppendorf管中加入400µl的1%SeakemGold:1%SDS,用枪头轻轻混匀。9、 将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟。注意事项:(1) 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。(2) 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。(3) 在混合细胞悬浊液和1%SeakemGold:1%SDS时要避免气泡的产生。(4) 混合物加入模具时不能产生气泡。(5) 在加1%SeakemGold:1%S
4、DS的过程中1%SeakemGold:1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。二、 细胞的裂解1、 在50ml的screw-captube上做好标记。2、 配制细胞裂解液(CLB):每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶K(20mg/ml),使其终浓度为0.1mg/ml,然后颠倒混匀。注意:蛋白酶K要置于冰上,配制好的细胞CLB也要置于冰上。3、 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、 如果想使胶块平齐,可以用刀片削去模具表面多余的部分。(1) 可重复利用的模具:打开模具,用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。(2) 一次性模具:撕掉模
5、具下面的胶带,用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中,将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时,转速约170转/分钟。7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。三、洗胶块1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管,盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意:把管倒置在吸水纸上,使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、 每管中加入15ml预热的纯水。3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上,放回50℃水浴摇床中,摇10分钟
6、。4、 倒掉水,用纯水再洗一次。、5、 倒掉水,加入15ml预热的TE,在50℃的水浴摇床中摇15分钟。6、 倒掉TE,用TE重复洗三次,每次10-15分钟。7、 倒掉TE,加入10mlTE,放在4℃冰箱保存备用。注意:要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA的酶切1、 在1.5mleppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液,混匀。试剂 µl/胶块 µl/10胶块纯水 180µl 1800µlBufferD 20µl 200µl总体积 200µl 2000µl注意:缓冲液要
7、置于冰上。3、 在每个1.5mleppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。4、 小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mleppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6、 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、 将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。8、 在用稀释缓冲液孵育的过程中,按照以下的比例配制酶切缓冲液,混匀。试剂 µl/胶块 µl/10胶块纯水 175µl 1750µlBufferD 20µl 200µl酶(10
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