旧版PFGE脉冲场电泳技术培训4CHEF故障排除

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1、脉冲场电泳技术（PFGE）培训王彤宇培训部Mar-2014CHEF脉冲场电泳的故障排除PFGETroubleShooting排除PFGE凝胶故障比较复杂，涉及到多种因素:实验室各自的技巧和技能实验室环境和设备条件试剂水质实验过程中意外的干扰和分心（一）PFGE技术故障排除的一般考虑因素通过改正一些不好的实验操作（习惯）能够帮助解决部分PFGE结果不佳的困惑精准地称量和定容（积）计算精确确认所有仪器设备处于良好的工作状态检查试剂化学品不得有沉淀、变色、絮状、过期采用正牌厂家的试剂耗材整个实验过程中戴手套确认玻璃器皿干净，不得有清洁剂、脏物碎片等残留，因为这些因素可能会影响凝胶小块的制备、裂解，从

2、而导致结果背景上出现斑点，脏点千万不要使用质量差的塑料容器，除非你确保它能被洗干净千万不要过分加热琼脂糖溶液配置酶混合液时要混合充分处理每种微生物实验时，采用合适的试剂、内切酶和电泳参数条件（一）PFGE技术故障排除的一般考虑因素想一想，对照上次成功的实验，有哪些因素变化了？过程方面：仪器设备试剂耗材人力因素考虑操作规程中的所有步骤，自检式提问是否故障源自于其中某一个环节？考虑和观察凝胶的每片区域，试图识别其中某个区域可能同失败的原因有关联要做到这些，操作者必须对每一步骤的的目的很熟悉，以及对每一步错误的操作可能带来的潜在后果明晰（一）PFGE技术故障排除的一般考虑因素（二）模糊一片的条带(F

3、uzzyorSmearyBands)Smearybandsaffectingsamplesaloneorsamples&standard分析：这是很典型的假象造成原因是蛋白酶消化或核酸内切酶切割不完全.只有小胶块的外周边缘接触到酶，得到了消化，而中心区域的样品却未被处理到位，所以样品电泳结果象个“盒子”改进建议：小胶块做薄点；降低制作小胶块的琼脂糖浓度酶处理时间适当延长采用新鲜酶试剂增加酶的浓度（二）类似现象或称为BoxShapedBands（三）歪曲的条带(DistortedBands)小胶块放入样品孔时没放均匀稳妥。它们应该填满梳孔的整个宽度，胶块上沿须同大的电泳凝胶表面齐平。“V”形或者

4、“√checkmark”形的条带是由于小胶块一端高出另一端而造成的小胶块放到梳齿上后，周围液体没吸干样品孔在灌制凝胶或拔出梳子时不小心扭曲循环泵的流速太慢检查连接管路有无扭结或堵塞了出入口.（三）歪曲的条带(DistortedBands)现象：液体样品加载到梳孔中，如果出现长方形宽阔条带或是【形，往往由于顶部的凝胶比底部冷却快的原因，所以条带会倾斜Liquidsamplesloadedtothetopofthewellproduceawidesquarebandordoubletwithsides(anopensquareshape).Thisiscausedbythetopofthegelb

5、eingcoolerthanthebottomofthegelsothatthebandrunsataslant.（三）歪曲的条带DistortedBands微微歪曲的条带------电极方面的问题（三）歪曲的条带DistortedBands歪曲的条带-----加样方面的问题（三）歪曲的条带DistortedBands歪曲的条带-----–汽泡的原因?（四）样品没有往下方向迁移SamplesNotMigratingDowntheGel样品没有进入凝胶:如果标准样品迁移正常的话,有可能样品在前处理时没有酶解完全电极问题–检测电流，电线连接，电泳时电极上的气泡，转换电场方向时…样品虽然进入了凝胶，

6、但在中途停了下来:琼脂糖类型和浓度?主机电源参数有否变化?(比如,输入电压值，电流值?)缓冲液类型和浓度?检查电路连接是否完好.在编有多套固定参数模块的方案中，仪器为第2套步骤自设的电压值为0.6V/cm.用户注意需要为第1套和第2设置电压值（四）样品迁移方向错误SamplesMigratetotheWrongDirection原因可能是程序错误，尤其在含有多状态参数组合的程序中出错。因为multi-state模式要求输入与垂直方向的夹角，一SamplesarenotgoinginthecorrectdirectionintheCHEFMapper,theproblemmaybeaprogra

7、mmingerrorwhileintheMulti-Statemode.Themulti-statemodewillaskforananglefromthevertical,ratherthantheincludedangle.So,forexample,theresearchermistakenlyprogramsin120degrees,thenthesamplewillruninthewro