基因工程酶ppt课件.ppt

《基因工程酶ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、1第二章基因工程Geneengineering2基因工程的定义应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品和服务的技术。3内容基因工程工具酶基因工程载体DNA提取与基因制备重组DNA向宿主细胞内转移技术重组基因的表达调控4基因工程的技术流程5工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：限制酶,聚合酶,连接酶,修饰酶(激酶,磷酸酶，核酸酶,甲基化酶)，蛋白酶，溶菌酶等。第一节基因工程工具酶6一、限制性内切酶（RestrictionEn

2、donuclease）1.细菌的限制一修饰现象被发现phage侵入E.coli可繁殖phage侵入另一种E.coli不可繁殖瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源DNA,修饰酶保护自身DNA71968年，Meselson从E．coliK株中分离出了第一个限制酶EcoK；同年Linn和Arber从E．coliB株中分离到限制酶EcoB。美Hopkings大学H.Smith从流感嗜血菌中分离Ⅱ型限制酶HindⅡArber,Smith获得1978年Nobel奖82.限制性核酸内切酶的定义和生物学功能定义

3、：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制酶。生物学功能：A.防御外来生物在体内繁殖。B.限制-修饰系统决定了噬菌体、病毒等具有种属特异性。C.阻止了生物远距离种属间杂交优势。9HindIII属名种名株名序数含义：流感嗜血杆菌d株(Haemophilusinfluenzaed)的第三种酶3.限制酶的命名第1个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母，大写；第2-3个字母是细菌种名的前两个字母，小写；第4个字母是株名的第一个字母，小写；用罗马数字表示发现的先后次序。104.限制酶系统分类1985年后大

4、量限制酶被发现，到2005年1月，已经发现3681种限制酶。限制性内切酶的分类Ⅰ型:特异识别、随机切割Ⅱ型：特异识别、同点切割Ⅲ型：特异识别、异地切割通常所指的限制酶即Ⅱ类酶11限制酶特性比较I型II型III型举例EcoBBamHIEcoPL亚基三种不同的亚基两个相同的亚基两种活性限制酶、修饰酶限制酶限制酶、修饰酶酶反应辅助因子ATP.mg++SAMmg++ATP.mg++SAM识别位点特性/4-6bp回文对称/识别位点TGAN8TGCTGGATCCAGACC切割位点可变，距离>1kb识别位点中距3端24-26bp克隆工作中用途

5、无有无SAM:硫一腺苷甲硫氨酸125.II型限制酶的识别特点A.识别顺序一般为4-7bpB.识别切割位点具有旋转对称性(回文结构)4bpHpaⅠCCGGHaeⅢGGCC5bpAvaⅡGGWCCEcoRⅡCCWGG6bpBamHⅠGGATTCSmaⅠCCCGGG136.限制酶的切割末端平端：缺口在识别序列对称轴上（HindII）5粘端：缺口在对称轴5’端一侧（EcoRI）3粘端：缺口在对称轴3’端一侧（PstI）限制酶产生的末端的连接A.匹配粘端:直接连接B.平末端:万能连接C.不匹配粘端：S1Nucleas

6、e切去突出端或Klenow补平147.识别位点与切割方式之间的关系A.识别不同，切割不同eg:BamHIEcoRI-GGATCC--AGATCT--CCTAGG--TCTAGA-B.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)eg:BamHIBg1Ⅱ-AGATCT-GGATCC-TCTAGA-CCTAGG15C.识别相同，切割不同eg:SmaIXmaI-CCCGGG--CCCGGG--GGGCCC--GGGCCC-D.识别相同，切割相同──同工酶同裂酶eg:HpaⅡMspⅠ-CCGG--C*CGG--GG

7、CC--GGCC-甲基化后不可切割甲基化后仍可切割168.限制酶反应的影响因素1.温度：一般37C有例外,如：SmaI25C，BclI50C，TaqI65C2.缓冲液：高、中、低盐之分3.时间：1-2小时4.反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积5.DNA纯度与构型：17A.纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA，EB，酚，乙醇，硫酸根，DNAB.构型：切超螺旋需更多的酶例:lgDNA,EcoRI切,1U超螺旋pUCl9,EcoRI2.5UHindⅢ5USalI10UNarI20U18酶单位的定义：1U：指

8、在适当的温度和缓冲液条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的酶量。缓冲液NaCl0,50,100mmol/L离子强度Tris-HClpH7.5-8.0MgCl2辅助因子10mmol/LDTT抗氧化，保护还