《基因工程酶》PPT课件

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1、基因工程工具酶基因工程工具酶自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克

2、隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。基因工程工具酶限制性内切酶甲基化酶DNA聚合酶RNA聚合酶磷酸激酶和磷酸酶核酸酶DNA连接酶限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现1、细胞的限制—修饰作用①50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(195

3、3)发现细菌的“限制”现象：Phageλ（k）感染E.colik不感染E.coliB【E.coliB限制λ（k）】②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB对λ(K)进行了修饰。E.coliB修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰。2、细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。3、限制性内切酶的发现①1

4、968年Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coliK中分离到另一限制性的内切酶。1970年Smith(美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶Ⅱ。②限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。③1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。限制性内切酶的分类：目前已发现的限制酶有三大类：限制性内切酶的命名EcoRIEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。限制

5、性内切酶的活性单位50μlBuffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。（buffer：pH=8.0，50mmol/LTris-HCl，10mmol/LMgCl2，1mmol/LDTT或巯基乙醇，100μgBSA/ml）限制性内切酶的性质及切割特点1、裂解产物均具有3′－羟基和5′－磷酸残基，5′P-NN…NN…NN-OH3′。2、识别序列及切点的高度专一。ECORI5‘……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’BamHIGGATCCCCTAGG3、有三种不同裂解方式：a.平齐未端环形

6、DNA:如HindⅢ、HpaⅡ、SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ。…..5َ′CCCGGG3′…..…..3′GGGCCC5′…..5َ′CCCGGG3′3′GGGCCC5َ′b.5′粘性末端5َ′GAATTC3′3′CTTAAG5َ′5َ′G5’AATTC3′3′CTTAA5’G5َ′如EcolⅠc.3′粘性末端如PstⅠ……5َ′CTGCAG3′…………3′GACGTC5َ′……5َ′CTGCAG3′3′GACGTC5َ′限制性内切酶的反应条件1、底物DNAa.DNA纯度:RNA与E结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。b.DNA浓度:〔DNA〕过大，会抑制酶活(影响酶分子

7、扩散)。如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下15h而1μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下1hc.识别位点及邻近位点特异性序列由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：①λDNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。②pBR322DNA有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。③XmaⅢ切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割d.DNA二