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《鲈鱼GK（Glucokinase）基因cDNA克隆【开题报告】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、毕业论文开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼GK（Glucokinase）基因cDNA克隆一、选题的背景与意义鲈鱼主要分布于我国东海、渤海沿海及通海淡水水体，是我国重要的养殖鱼类，在我国广泛的养殖。鲈鱼肉质鲜美，营养价值很高，具有较高的经济价值。目前鱼类对碳水化合物的消化和代谢能力较差，缺乏对血糖水平的调控能力。众多的研究资料表明，摄入高碳水化合物通常会导致鱼体出现持续的高血糖、肝肿大、肝糖原积累、生长率和饲料效率降低。影响鱼类利用饲料的因素很多，包括鱼的食性、生长发育、胰岛素水平、消化及代谢酶、能量代谢水平等内因及碳水化合物的种类、
2、含量、摄食频率、环境温度等外因。葡萄糖激酶（Glucokinase,GK）是糖酵解过程中很重要的限速酶，当哺乳动物血糖增高时，GK活性诱导性增强，从而增强糖酵解。早期的研究者认为鱼类可能缺乏GK，因而不能正常分解利用葡萄糖，导致鱼类摄食血糖后血糖持续偏高，但近年的研究在鱼类的肝脏中发现了GK，饲料碳水化合物能够诱导鱼类肝脏GK的活性升高，表明鱼类利用碳水化合物差的原因而不是缺乏GK鲤利用碳水化合物要好于金雕和虹鳟，且GK活性受碳水化合物的诱导比金雕和虹鳟更快。而对于鲈鱼，目前还没有对GK深入的研究。二、研究的基本内容与拟解决的主
3、要问题：基本内容：本研究通过鲈鱼各组织RNA的提取，再通过自己设计的引物和PCR技术来提取鲈鱼GK的部分核心片段，然后连接到载体上并导入感受态细胞中送测序公司测序，之后于NCBI比对，以得到鲈鱼CPT-2基因cDNA序列。主要问题：鲈鱼总RNA的提取的问题，提取核心序列时引物设计的问题，由于引物的设计有一定的未知性，能否的到核心序列的关键就在此。三、研究的方法与技术路线：1、鲈鱼各组织获得：新杀死的鲈鱼中取出肌肉、肝脏、心脏、脑、皮肤、肠组织迅速放入-80℃冰箱中待用。2、RNA的提取：将组织从-80℃冰箱中取出，放在冰上解冻，
4、待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织于EP管中，剪碎组织，加入适量的TRIZOL试剂，剧烈震荡，冰上静置5分钟，再加入0.2ml氯仿，剧烈震荡后于4℃12000r/min离心30s，取上层水相于一新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后-20℃静置30min；8000r/min离心10min，弃上清，沉淀用现配的75%乙醇洗涤后室温干燥，干燥后用30μl的无酶水溶解，得RNA提取液。1、引物设计：在NCBI上查找人、小鼠、大鼠、虹鳟鱼的GKcDNA序列，通过软件BioEdit和Primer5.0来设计引物。4、GKc
5、DNA的获得：在EP管中加入2μl的鲈鱼RNA，上引下引各1μl,5×buffer4μl，dNTP1μl，oligoDT1μl,M-MLV1μl,然后加入蒸馏水至体系共20μl混匀.于42℃反应1小时，冰溶-20℃保存。5、聚合酶链式反应（PCR）扩增：取2μL步骤4中得到的液体来进行PCR。PCR产物进行凝胶电泳，如电泳的结果和预料的核苷酸长度相似，则切胶回收。否则重否以上步骤。6、切胶回收的产物介入质粒并导入感受态细胞中，送测序公司测序。7、得到的序列于NCBI上已的到的GK（最好是鱼类）做序列比对，看得到的序列是否是鲈鱼G
6、K的部分序列。四、研究的总体安排与进度：2010年12月：实验前期准备1.查询中英文资料、文献2.设计实验方案3.准备实验中所需的仪器和材料2011年1月：进行试验1.RNA提取2.引物设计3.cDNA的克隆4.PCR扩增5.送公司测序2011年4月：撰写论文1.实验数据整理、分析2.完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月：准备答辩1.完成论文正稿2.准备毕业答辩五、主要参考文献：[1]方亦斌,邹大进.葡萄糖激酶调节蛋白的研究进展.J.华夏医学,2003,16:422-423.[2]Alegre,M.,Ciudad,C.J.
7、,Fillat,C.,etal.Determinationofglucose-6-phosphataseactivityusingtheglucosedehydrogenase-coupledreaction.Anal.Biochem.1988,173,185-189.[3]McGarryJ.D.,BrownN.F.,1997.Themitochondrialcarnitinepalmitoyltransferasesystem.Fromconcepttomolecularanalysis.Biochem.J.244,1–14.
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