鲈鱼CPT I基因cDNA的克隆【开题报告+文献综述+毕业设计】

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1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼CPTI基因cDNA的克隆一、选题的背景与意义肉毒碱棕榈酰转移酶（carnitinepalmitoyltransferases,CPT,EC.2.3.1.2）是脂肪酸的β-氧化中主要的限制酶，丙二酸单酰辅酶A是其主要抑制剂。该酶系统由两种类型组成：肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ（CPTⅠ）和肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅱ（CPTⅡ）。线粒体内细胞质一侧的脂酰CoA由肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶Ⅰ催化与肉碱结合形成脂酰肉碱，脂酰肉碱通过线粒体内膜的移位酶的作用穿过线粒体内膜，进入线粒体。在线粒体内基质的一侧的肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶Ⅱ的催化下，脂酰肉碱上的脂酰基又转移到Co

2、A上，重新形成脂酰CoA,成为β-氧化的底物。而鲈鱼(Lateolabraxjapomcus)肉质坚实，洁白细嫩，肉味鲜美，营养特别丰富，是人类优质的蛋白质来源，也是我国水产从业人员捕捞、养殖的主要高档水产品种，经济价值很高,在我国渔业经济中占重要地位。目前大量的对肉毒碱棕榈酰转移酶的研究主要集中在哺乳动物如人、大鼠方面等上。国内黄其春等（2008）报道，猪肝脏和肌肉肉碱脂酰转移酶I基因片段克隆及序列分析。他们的研究旨在对肉毒碱棕榈酰转移酶转运机制和该酶对细胞代谢的影响及缺乏此酶对机体的影响等，但在鱼类方面研究较少，只是在鱼的肝脏和肌肉中测出有CPTⅠ的活性（Froyland1998等）。本研

3、究通过对鲈鱼CPTⅠ基因的克隆来，来研究CPT对鲈鱼鱼体的影响，主要是包括鱼体生长发育方面（水温适应），鱼肉口感方面及对人类身体的影响等做理论依据，为鲈鱼的最优养殖做指导二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：本研究通过提取鲈鱼肝脏中总RNA，并逆转录成cDNA，将所得到cDNA的进行PCR克隆从而得到该基因的核心序列，最后通过RACE技术拉出全长，得出该基因全长序列。为以后CPTI基因分析、深入研究营养物质如甜菜碱等对鲈鱼肝脏、肌肉组织CPTImRNA表达的影响及阐明其分解脂类物质的分子基础等做铺垫，从而进一步从分子水平研究肉毒碱棕榈酰转移酶在鱼体中的作用，为最后通过基因工程技术改变CPTI的

4、活性，并将其应用于生产。拟解决问题有实验前鲈鱼培养条件确定，PCR引物设计合理性，PCR克隆最优条件的确定及等。三、研究的方法与技术路线：1.RNA的提取及逆转录表达总RNA在鲈鱼的肝脏中是通过Trizol试剂盒说明书提取出来：将鲈鱼肝剪碎后放入研钵中倒入液氮进行研磨，加入1mLTrizol试剂呈液态后转移到经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的eppendorf管中在15℃~30℃室温中放置5min，加入200uL氯仿手摇匀5s并放置2~3min，在4℃1200r/min离心5min，取上层水相转至新的EP管中，加入0.5mL异丙醇，室温放10min，在4℃1200r/min离心10min，弃上

5、清，沉淀用现配的75％乙醇洗涤后室温干燥，干燥后用30uL的无酶水溶解．即得总RNA提取液。取两个干净的0.5mLEP管，依次加入RNA0.5uL，oligodT引物(50umol/L)1uL，5×buffer5uL，dNTP(10mmol/L)1uL，M—MLV逆转录酶(200U/uL)1uL，加DEPC处理水至总体积为25uL(以上均冰上操作)，离心后，置于42℃水浴60min，65℃水浴10min。得到cDNA产物，置于-20℃储存。2.设计PCR引物在Genbank中找出人（human），小鼠（Musmusculus），虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，大西洋鲷(Sparu

6、saurata)，牛（BosTaurus），鸡（Gallusgallus），食蟹猴（Macacafascicularis），斑马鱼（Daniorerio），绵羊（Ovisaries），野猪（Susscrofa）及大西洋鲑鱼（Salmosalar）肝中的CPTⅠ的cDNA序列，通过bioedit软件进行同源性对比，找出同源性较好的片段，然后通过primer.5软件设计出CPTⅠ的上游引物和下游引物，然后将此引物在NCBI数据库中进行BLSAT下，选出最优的几对引物进行PCR实验。3.PCR及其产物处理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)反应包含变性，退火，延伸

7、三步骤。将反应管在50uL体系（5uLbuffer，1uLcDNA模版，1uL各dNTP,1uL上游引物,1uL下游引物，0.5uLTaqDNA聚合酶，灭菌蒸馏水37.5uL）中进行PCR反应。此反应条件为94℃预变性5min；接着30个循环：94℃1min,52℃～45℃（前8个循环降落）1min,72℃2min；最后72℃延伸2min。然后将PCR产物混合在1%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行，加入适