鲈鱼CD4基因的cDNA克隆【开题报告+文献综述+优秀毕业设计】

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1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼CD4基因的cDNA克隆一、选题的背景与意义鲈鱼（Lateolabraxjaponicus）属鲈形目，鮨科，花鲈属，是我国重要的海水养殖经济鱼类。近年来，随着鲈鱼养殖业的迅猛发展，养殖密度日益扩大，鱼体免疫能力逐渐下降，发病率日趋提高，造成严重的经济损失。鱼类的免疫系统日益为人所关注，对鱼类免疫系统的研究不仅为高等生物免疫演化途径提供重要的参考,同时也为日趋严重的养殖鱼类的病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。鱼类主要的免疫细胞包括淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、血栓细胞、树突状细胞(DC)、黑色素巨噬细胞等。淋巴细胞是机体免疫应答功

2、能的重要细胞成分，其中T淋巴细胞介导细胞性免疫。T淋巴细胞中，CD4主要表达于辅助T（Th）细胞，是Th细胞T细胞抗原受体（Tcellreceptor;TCR）识别抗原的共受体，与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导。近年来在鱼类免疫相关基因方面进展迅速,已经克隆出包括牙鲆、虹鳟、鲫鱼、斑马鱼等多种鱼类的T细胞表达的主要基因,如TCR(包括α、β、γ、δ)、Ikaros(T细胞早期表达的转录因子)、p56lck(T细胞特异性激酶)、MHCI/II、CD3、CD4、CD8等(KurobeT,etal.2005,LangenaudM,etal.2005,T

3、ayloraiS,etal.2005,BuonocoreF,etal.2006,CuestaA,etal.2006)。但目前国内对于这些基因研究不多，对CD4基因的研究更少。该实验以鲈鱼为实验材料，对其CD4基因进行克隆，增加关于鲈鱼T细胞免疫应答的新的了解，以期为鱼类的免疫系统研究做一点基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：内容：本研究通过提取鲈鱼肾脏等组织中RNA，逆转录成cDNA，设计兼并引物，对该基因进行PCR克隆从而得到该基因的核心序列。为以后CD4基因分析、表达，鉴别真骨鱼类的T细胞亚群、鱼类养殖抗病做基础研究。拟解决问题有实验前鲈鱼培养条件，RNA提取过程中出现

4、的污染情况，PCR克隆最优条件的确定及琼脂糖凝胶电泳时胶体的浓度等。三、研究的方法与技术路线：1．鲈鱼各组织获得：鲈鱼中取出肌肉、肝脏、心脏、脑、肾脏、皮肤、肠组织迅速放入-80℃冰箱中待用。2．RNA的提取：将组织从-80℃冰箱中取出，放在冰上解冻，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织于EP管中，剪碎组织。a.分层：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min，使样品充分裂解；每1mlTrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。b.RNA沉淀：4℃

5、12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。c.RNA漂洗:RNA沉淀中加入1ml75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mlTrizol加入1ml75％乙醇；4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2min晾干沉淀。d.溶解RNA：沉淀中加入50-100μlR

6、Nase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA。3．设计引物：主要通过软件BioEdit和Primer5.0来完成。4．RNA逆转录成cDNA：在EP管中加入2μl的RNA，1μl上游引物、1μl下游引物，1μl的反转录酶和1μl的oligodT，加入蒸馏水至体系共20μl。于42℃反应1h。5．通过聚合酶链式反应（PCR）扩增：PCR体系：（50μl）ddH2O34.5μlbuffer5μldNTP4μlF13μlR13μlTaq酶0.5μl模板0.5μl6．将PCR产物取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，若条带符合大小则切胶回收（用试剂盒）。7．切胶回收的产物连接上载体，转化到感受态

7、细胞中，涂板，37℃过夜培养。8．测序9．结果分析四、研究的总体安排与进度：2010年9-10月预实验2010年12月：实验前期准备1.查询中英文资料、文献2.翻译2篇外文文献3.撰写综述2011年1-3月：进行试验1.RNA提取2.引物设计3.cDNA提取4.PCR克隆5.送公司测序2011年3月：撰写论文1.实验数据整理、分析2.完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月：准备答辩1.完成论文正稿2.准备毕业答辩五、主要参考文献：[1]VanderSarAM,Ap