讲义-动物微生物学实验指导

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1、讲义•动物微生物学实验指导动物微生物学实验指导指导教师：郭春秋李娜目录实验1细菌的简单染色和革兰氏染色实验2细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察实验3微生物细胞形态及菌落特征观察实验4培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术实验5微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数实验6微生物细胞大小测定及显微镜直接计数附录1常用培养基配方附录2常用染色液的配制附录3常用试剂和指示剂的配制参考书目实验1细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1、学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法；2、学习显微镜油镜观察的方法；二、实验内容1、细菌的简单染色；2、细菌的革兰氏染色；三、实验原理简单染色法是一种最基本

2、的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于屮性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红)等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色。简单染色一般难于辨别细细胞的构造。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类。这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同，G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用

3、乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染吋的颜色，即紫色。四、实验材料1、活材料:培养12〜16h的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)>枯草杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),培养24h的大肠杆菌(Escherichiacoli)。2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃

4、红、复红、二甲苯、香柏油。五、实验用品废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、银子、无菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有75%乙醇的玻片回收缸、生物显微镜等。六、实验方法(-)简单染色1＞涂片:用消毒棉球擦拭双手，用银子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馅水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬+—+—液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液2〜3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2~3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：让涂片自

5、然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。★是否还有英它方法？3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2~3次固定，以不烫手为宜。★为什么要进行该步骤？4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1〜2mino5、水洗：水洗去涂片上的染色液。6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。★怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？(-)革兰氏染色1、涂片：涂片方法与简单染色涂片法相同。★涂片厚薄对结果有影响吗

6、？2、晾干：与简单染色法相同。3、固定：与简单染色法相同。4、结晶紫初染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色lmin,以盖满细菌涂血为宜。之后倾去染色液，用水小心地冲洗。5、碘液媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染lmin后用水洗去碘液。★此步可否省去？6、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20-25S至流出液无色，立即水洗。★为什么要立即水洗？7、复染:滴加蕃红复染2~5min,然后用水洗去涂片上的番红染色液。8、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。9、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。10、实验完毕后

7、的处理(1)将浸过油的镜头按下述方法擦试干净：%1先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；%1用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2~3次；%1再用干净的擦镜纸将镜头擦2~3次，注意擦镜头时向一个方向擦试。(2)观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有75%乙醇溶液的回收缸中。⑶显微镜复原并做好使用情况登记。七、作业与思考(%1)、绘图1、简单染色后绘出苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)＞金黄色葡萄球菌(Staphylococcu